核酸のエピジェネティック修飾の化学的検出

• 研究課題/領域番号: 13F03342
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 外国
• 研究分野: 生体関連化学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 岡本 晃充 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (60314233)
• 研究分担者: JEONG Hyun Seok 東京大学, 先端科学技術研究センター, 外国人特別研究員 ; JEONG Hyun Seok 東京大学, 先端科学技術研究センター, 外国人特別研究員
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円); 2014年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 2013年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
• キーワード: RNA / エピジェネティクス / 化学修飾 / メチルアデニン / メチル化酵素 / プロテオミクス

研究実績の概要

RNAのエピジェネティックな修飾は、遺伝子発現、細胞分化、転写後の多くの生物学的機能を制御しており、その検出に対する研究が分子レベルで進められなければならない。しかしながら、RNA修飾に対する効果的な研究手法が未熟であり、チャレンジングな挑戦課題として残されている。上述のm6Aは以前からその存在は指摘されているところであるが、それを効率的に検出できる手法は開発されていない。したがって、配列選択的でかつ簡便で信頼できるm6A検出法が求められている。m6Aを認識する新しい酵素ALKBH5と呼ばれる酵素は、ノンヘム鉄と2-ケトグルタル酸を含む酸化酵素であり、m6Aを酸化的に脱メチル化する。ALKBH5は、m6Aの認識分子として有効かもしれない。本研究では、ALKBH5の核酸修飾を用いて、m6Aを配列特異的に認識する系を開発した。
1) 酵素群の発現：ALKBH5 FL、ALKBH5 CD、Sortase Aを発現させた。ALKBH5については、特に精製を簡便化するためにチオレドキシン部分を連結したものを用意した。
2) トランスペプチデーション：ALKBH5と核酸を結合するために、まずSortaseAを用いた。アジド基を含むGGGK-アジドとDBCO基を含むRNAを用意した。ALKBH5のC末端は、LPETGGで終えているので、それとGGGK-アジドおよびSortaseAと混合することにより、トランスペプチデーションを引き起こし目的のアジド修飾C末端を含むALKBH5を得ることができた。さらに、DBCO標識したRNAとアジド修飾ALKBH5を混合することにより、RNAが連結したALKBH5を得ることができた。
3) m6Aの配列選択的脱メチル化について：候補になるm6A修飾RNAを合成した。前項で得られたRNA連結ALKBH5の量が本事件を行うには十分な量ではなかったため、追合成中である。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Diazirine Photocrosslinking Recruits Activated FTO Demethylase Complexes for Specific N6-methyladenosine Recognition (2015)
  • 著者名/発表者名: Jeong, H. S.; Hayashi, G.; Okamoto, A
  • 雑誌名: ACS Chem. Biol. 巻: 10 号: 6 ページ: 1450-1455
  • DOI: 10.1021/cb5010096
  • 査読あり
• [雑誌論文] FTO-Dependent Demethylation of N6-Methyladenosine Regulates mRNA Splicing and Is Required for Adipogenesis (2014)
  • 著者名/発表者名: Yang, Y. G.; Zhao, X.; Yang, Y.; Sun, B. F.; Shi, Y.; Yang, X.; Xiao, W.; Hao, Y.; Ping, X.-L.; Chen, Y.; Wang, W.-J.; Jin, K.-X.; Wang, X.; Huang, C.; Fu, Y.; Ge, X.; Song, S.; Jeong, H. S.; Yanagisawa, H.; Niu, Y.; Jia, G.; Wu, W.; Tong, W.-M.; Okamoto, A.; He, C.; Danielsen, J. M.; Wang, X.
  • 雑誌名: Cell Res. 巻: 24 ページ: 1403-1419
  • 査読あり
• [雑誌論文] Whole-mount MeFISH : A novel technique for simultaneous visualization of specific DNA methylation and protein/RNA expression (2014)
  • 著者名/発表者名: Shiura, H. ; Okamoto, A. ; Sasaki, H. ; Abe, K.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 9-4 号: 4 ページ: e95750-e95750
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0095750
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A nucleic acid probe labeled with desmethyl thiazole orange : A new type of hybridization-sensitive fluorescent oligonucleotide for live-cell RNA imaging (2013)
  • 著者名/発表者名: Okamoto, A. ; Sugizaki, K. ; Yuki, M. ; Yanagisawa, H. ; Ikeda, S. ; Sueoka, T. ; Hayashi, G. ; Wang, D. O
  • 雑誌名: Org. Biomol. Chem. 巻: 11-2 号: 2 ページ: 362-371
  • DOI: 10.1039/c2ob26707a
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of the Triplet State of Hybridization-Sensitive DNA Probe by Using Fluorescence Correlation Spectroscopy (2013)
  • 著者名/発表者名: Shin, H. -S. ; Okamoto, A. ; Sako, Y. ; Kim, S. W. ; Kim, S. Y. ; Pack, C. -G.
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. A 巻: 117-1 号: 1 ページ: 27-33
  • DOI: 10.1021/jp307018k
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fluorescent triplex-forming DNA oligonucleotides labeled with a thiazole orange dimer unit (2013)
  • 著者名/発表者名: Ikeda, S. ; Yanagisawa, H. ; Yuki, M. ; Okamoto, A.
  • 雑誌名: Artif. DNA PNA XNA 巻: 4-1 号: 1 ページ: 19-27
  • DOI: 10.4161/adna.24102
  • 査読あり
• [雑誌論文] Probe Design for Effective Fluorescent Imaging of Intracellular RNA (2013)
  • 著者名/発表者名: Hayashi, G. ; Okamoto, A.
  • 雑誌名: Chem. Rec. 巻: 13-2 号: 2 ページ: 209-217
  • DOI: 10.1002/tcr.201200026
  • 査読あり
• [雑誌論文] Application of caged fluorescent nucleotides to live-cell RNA imaging (2013)
  • 著者名/発表者名: Okamoto, A.
  • 雑誌名: Methods Mol. Biol. 巻: 1039 ページ: 303-318
  • DOI: 10.1007/978-1-62703-535-4_24
  • ISBN: 9781627035347, 9781627035354
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sequence-specific microscopic visualization of DNA methylation status at satelliterepeats in individual cell nuclei and chromosomes (2013)
  • 著者名/発表者名: Li, Y. ; Miyanari, Y. ; Shirane, K. ; Nitta, H. ; Kubota, T. ; Ohashi, H. ; Okamoto, A. ; Sasaki, H.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 巻: 41-19 号: 19 ページ: e186-e186
  • DOI: 10.1093/nar/gkt766
  • 査読あり
• [学会発表] Diazirine Photocrosslinking Recruits Activated FTO Demethylase Complexes for Specific N6-methyladenosine Recognition (2015)
  • 著者名/発表者名: JEONG, Hyun Seok; OKAMOTO, Akimitsu
  • 学会等名: 日本化学会第95春季年会
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] Modified ECHO Probes for Effective Intracellular RNA Imaging (2013)
  • 著者名/発表者名: Akimitsu Okamoto, Kaori Sugizaki, Takuma Sueoka, Katsuya Takeda, Gosuke Hayashi, Shuji Ikeda, Mizue Yuki and Dan Ohtan Wang
  • 学会等名: The 40th International Symousium on Nucleic Acid Chemistry 2013 (ISNAC2013)
  • 発表場所: Yokohama, Japan
  • 年月日: 2013-11-13
• [学会発表] Tungsten reacting with 5-hydroxymethylcytosine (2013)
  • 著者名/発表者名: Akimitsu Okamoto
  • 学会等名: Epigenomics of Common Diseases 2013
  • 発表場所: Hinxton, UK
  • 年月日: 2013-11-07
• [備考]
  • URL: http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/okamoto/