人工ヌクレアーゼを用いた標的遺伝子組換えメダカ作出技術の確立

• 研究課題/領域番号: 13J01682
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 遺伝・ゲノム動態
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 安齋 賢 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円); 2015年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 2014年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 2013年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: メダカ / ゲノム編集 / CRISPR/Cas / TALEN / ヌクレアーゼ / 標的遺伝子組換え / CRISPR / 相同組換え

研究実績の概要

DNAシークエンス技術の発達に伴い、ゲノム情報の整備が急速に進む中、個々の遺伝子の機能を個体レベルで詳細に解析するための逆遺伝学的手法の重要性は増大しつつある。本研究では、任意のゲノムDNAを切断可能な人工ヌクレアーゼを用いて、メダカでの胚における標的遺伝子組換え技術を確立することを目的とした。本年度は前年度に引き続き、CRISPR/Casシステムによる標的遺伝子組み換えの高効率化のための条件検討を行った。
本研究では、骨格筋特異的に強く発現するOlMA1遺伝子への標的遺伝子組換えによるGFP遺伝子の導入をモデル実験として、導入効率の比較検討を進めた。始めに、特に再現性において問題となった部分として、ドナーDNAへのRNaseの混入、及び転写RNAへのDNaseの混入の2点について、それぞれProteinase処理の追加や精製キットの変更を行った。続いて、必要な各核酸の導入量や導入に用いるドナーベクター中の相同配列の長さ、相同配列を露出させるためのBait配列について、導入効率に及ぼす影響を比較検討し、ある程度効率的に標的遺伝子組換えを行うためのプロトコルを確立しつつある。現在、当初計画の通り、更なる相同組換え効率の上昇を期待して、DNA二重鎖切断修復に関わる分子の操作についても検討を進めている。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Chronic fluoxetine treatment induces anxiolytic responses and altered social behaviors in medaka, Oryzias latipes (2016)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Ansai, Hiroshi Hosokawa, Shingo Maegawa, Masato Kinoshita
  • 雑誌名: Behavioural Brain Research 巻: 303 ページ: 126-136
  • DOI: 10.1016/j.bbr.2016.01.050
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] An Essential Role of the Arginine Vasotocin System in Mate-Guarding Behaviors in Triadic Relationships of Medaka Fish (Oryzias latipes). (2015)
  • 著者名/発表者名: Yokoi S, Okuyama T, Kamei Y, Naruse K, Taniguchi Y, Ansai S, Kinoshita M, Young LJ, Takemori N, Kubo T, Takeuchi H
  • 雑誌名: PLoS Genetics 巻: なし 号: 2 ページ: e1005009-e1005009
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005009
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Viable neuronopathic Gaucher disease model in medaka (Oryzias latipes) displays axonal accumulation of alpha-synuclein (2015)
  • 著者名/発表者名: Norihito Uemura, Masato Koike, Satoshi Ansai, Masato Kinoshita, Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Hideaki Matsui, Kiyoshi Naruse, Naoaki Sakamoto, Yasuo Uchiyama, Takeshi Todo, Shunichi Takeda, Hodaka Yamakado, Ryosuke Takahashi
  • 雑誌名: PLoS Genetics 巻: 11 号: 4 ページ: 1-14
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005065
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka (2014)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Ansai, Masato Kinoshita
  • 雑誌名: Biology Open 巻: 3 号: 5 ページ: 362-371
  • DOI: 10.1242/bio.20148177
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Design, evaluation, and screening methods for efficient targeted mutage nesis with TALENs' in medaka. (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Ansai, K. Inohaya, Y. Yoshiu ra, M. Schartl, N. Uemura, R. Takahashi, M. Kinoshita
  • 雑誌名: Development, Growth & Differentiation 巻: 56 号: 1 ページ: 98-107
  • DOI: 10.1111/dgd.12104
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Behavioral alterations in medaka caused by serotonin deficiency in the raphe neurons (2016)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Ansai, Hiroshi Hosokawa, Shingo Maegawa, Youhei Washio, Kenji Sato, Masato Kinoshita
  • 学会等名: 3rd Medaka Strategic Meeting/17th Australia and New Zealand Zebrafish Meeting
  • 発表場所: フリンダーズ（オーストラリア）
  • 年月日: 2016-02-01
  • 国際学会
• [学会発表] PhiC31インテグレースによる高効率遺伝子導入に用いるLanding site (attP) 導入メダカ系統の樹立 (2015)
  • 著者名/発表者名: 石川 時郎, 安齋 賢, 岡田 徹也, 木下 政人, 森 和俊
  • 学会等名: 21th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • 発表場所: 大阪大学銀杏会館（大阪府吹田市）
  • 年月日: 2015-09-19
• [学会発表] Behavioral phenotyping test battery for genetically modified fish (2014)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Ansai, Shingo Maegawa, Masato Kinoshita, Hiroshi Hosokawa
  • 学会等名: 20th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-09-22
• [学会発表] 遺伝子改変メダカの行動特性解析のための行動テストバッテリーの開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 安齋 賢, 前川 真吾, 木下 政人, 細川 浩
  • 学会等名: 日本動物学会第85回仙台大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2014-09-11
• [学会発表] Efficient method for targeted mutagenesis in medaka using TALENs and CRISPR/Cas system (2014)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Ansai, Masato Kinoshita
  • 学会等名: 11th International Conference on Zebrafish Development and Genetics
  • 発表場所: Madison, WI
  • 年月日: 2014-06-24 – 2014-06-28
• [学会発表] Efficient and simple method for targeted mutagenesis in medaka using TALENs and CRISPR/Cas system (2014)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Ansai, Masato Kinoshita
  • 学会等名: 2nd Strategical Meeting for Medaka Research
  • 発表場所: Sevilla, Spain
  • 年月日: 2014-04-10 – 2014-04-12
• [学会発表] CRISPR/Casシステムを利用したメダカにおける簡便・高効率な標的遺伝子破壊 (2013)
  • 著者名/発表者名: 安齋賢, 木下政人
  • 学会等名: 第36回本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸国際展示場(兵庫県神戸市)
  • 年月日: 2013-12-05
  • 招待講演
• [学会発表] TALEN及びCRISPR/Casを用いた標的遺伝子破壊メダカ作出技術の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 安齋賢, 木下政人
  • 学会等名: 第10回水生動物の行動と神経系シンポジウム
  • 発表場所: 鹿児島大学理学部(鹿児島県鹿児島市)
  • 年月日: 2013-11-30
  • 招待講演
• [学会発表] CRISPR/Casシステムによる遺伝子破壊メダカの作出 (2013)
  • 著者名/発表者名: 安齋賢, 木下政人
  • 学会等名: 日本動物学会第84回岡山大会
  • 発表場所: 岡山大学津島キャンパス(岡山県岡山市)
  • 年月日: 2013-09-27
  • 招待講演
• [学会発表] CRISPR/Cas system-an efficient and simple tool for targeted genome editing in medaka (2013)
  • 著者名/発表者名: S. Ansai, M. Kinoshita
  • 学会等名: 19th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • 発表場所: 仙台市情報・産業プラザ(宮城県仙台市)
  • 招待講演
• [図書] Targeted genome editing using site-specific nucleases (2015)
  • 著者名/発表者名: Atsuo Kawahara, Taijiro Yabe, Satoshi Ansai, Shinji Takada, Masato Kinoshita
  • 総ページ数: 205
  • 出版者: Springer
• [図書] 実験医学別冊 最強のステップUPシリーズ今すぐ始めるゲノム編集TALEN&CRISPR/Cas9の必須知織と実験プロトコール (2014)
  • 著者名/発表者名: 山本卓, 佐久間哲史, 落合博, 木下政人, 安齋賢, 久野悠, 川原敦雄, 他(計45名)
  • 総ページ数: 205
  • 出版者: 羊土社
• [備考] 研究者代表者個人ホームページ
  • URL: http://www.mbf.marine.kais.kyoto-u.ac.jp/~ansai/cv.html