| 研究課題/領域番号 |
13J05019
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
古池 美彦 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2014年度)
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| 配分額 *注記 |
2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
2014年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2013年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 構造生物化学 / プロトン移動 / 原子分解能 / タンパク質結晶構造解析 / 超高分解能 / 結晶相pH滴定 / 酸解離定数pKa / プロトン化状熊 |
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| 研究実績の概要 |
ヌクレオチド代謝系の末端で精製されるADPリボース(ADPRase)はADPリボース加水分解酵素(ADPRase)によって無害化される。ADPRaseは補因子である二価金属イオンを利用しながら競争的な酸塩基触媒を実現しており、その反応機構を明らかにしようという目的でこれまでに30個程度の結晶構造がすでに報告されている。しかしながらADPRaseの活性部位に保存されている複数のGlu残基のプロトン化状態および酸解離特性についてはこれまで全く知られてこなかった。本研究課題でデザインされたADPRase結晶相pH滴定実験において、これら重要なGlu残基側鎖のサブÅスケールでの微細な構造変化を確認することができた。基質が結合していないアポ状態においてはGlu82のpKaは4.3付近、酵素基質二元複合体においてはGlu85のpKaは4.6付近にあることが分かった。これによってADPRase活性のpH依存性が原子構造の立場からも説明され、新たなADPRase反応機構を提唱するに至った。この結晶相pH滴定実験はタンパク質結晶構造解析の新たな可能性を見出したと共に、酵素学的にも興味深い結果を与えてくれることが分かった。提唱した反応機構を実証するため、より水素原子やプロトンを可視化できる中性子結晶構造解析に向けての準備も進めた。これまでよりも100倍程度大きな体積をもつADPRase結晶を調製することに成功し、重水置換操作による結晶への影響も評価済みである。パルス中性子源の定常的な運転に合わせて、中性子結晶構造解析をすぐに始めることができる段階にまで至った。当初から想定していた実施計画の大半の部分を実際に遂行することができたと考えている。
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| 現在までの達成度 (段落) |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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