糖鎖プロセシング酵素と相同性を有する酵素の立体構造解析に基づく新規オリゴ糖の創出

• 研究課題/領域番号: 13J07279
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 応用生物化学
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 宮崎 剛亜 東京農工大学, 大学院農学研究院, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 2,070千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 270千円); 2014年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2013年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: N結合型糖鎖 / 糖質加水分解酵素 / オリゴ糖 / X線結晶構造解析 / グライコシンターゼ / フッ化糖 / グルコシダーゼ / ガラクトシダーゼ

研究実績の概要

本研究は、真核生物の有するN結合型糖鎖プロセシング酵素およびそれと相同性を有する細菌由来機能未知酵素を対象とし、X線結晶構造解析に基づく反応機構の解明および基質特異性に関わるアミノ酸残基の特定、さらにグライコシンターゼ化による有用なオリゴ糖および糖鎖合成酵素を作出することを目的とした。前年度より引き続き、プロセシングα-グルコシダーゼⅠが属する糖質加水分解酵素ファミリー63（GH63）、そしてプロセシングα-グルコシダーゼⅡが属するファミリー31（GH31）の酵素について研究を行い、主に以下の成果を得た。
1. 大腸菌由来GH63酵素YgjKは前年度までに二糖2-O-α-グルコシルガラクトースを生成する2種類のグライコシンターゼ変異体（D324NおよびE727A）を得ている。前年度に行った二糖との複合体構造解析に基づき新たな変異体を構築し、糖の合成能を比較した。その結果、GH63酵素の活性部位近傍に保存されているチロシン残基をフェニルアラニンに置換した変異体のオリゴ糖合成能が最も高いことがわかった。
2. 近年グルコシル-/マンノシル-グリセリン酸加水分解酵素と同定された好熱菌由来GH63酵素（Tt8MGH）のX線結晶構造解析を行った。Tt8MGHのアポ構造、生成物であるグルコースまたはグリセリン酸との複合体構造を1.67-2.10 Å分解能で決定し、Tt8MGHに特徴的な3つのループが基質認識に関与していることがわかった。
3. 細菌由来GH31機能未知酵素（PsGal31A）の大腸菌発現系の構築、組換え酵素の性質解析を行ったところ、GH31として初めてα-ガラクトシダーゼ活性を示す酵素であることがわかった。また、X線結晶構造解析によりPsGal31Aの立体構造を明らかにし、本酵素のユニークな基質特異性に関する知見を得た。
以上の成果により、GH31およびGH63に属するユニークな基質特異性を有する加水分解酵素を新規なオリゴ糖合成酵素に変換するための基盤を確立した。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] The side chain of a glycosylated asparagine residue is important for the stability of isopullulanase. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takatsugu Miyazaki, Hiroyuki Yashiro, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
  • 雑誌名: Journal of Biochemistry 巻: 157 号: 4 ページ: 225-234
  • DOI: 10.1093/jb/mvu065
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystal structure and substrate-binding mode of GH63 mannosylglycerate hydrolase from Thermus thermophilus HB8. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takatsugu Miyazaki, Megumi Ichikawa, Hitoshi Iino, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
  • 雑誌名: Journal of Structural Biology 巻: 190 号: 1 ページ: 21-30
  • DOI: 10.1016/j.jsb.2015.02.006
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structural and biochemical characterization of novel bacterial α-galactosidases belonging to glycoside hydrolase family 31 (2015)
  • 著者名/発表者名: Takatsugu Miyazaki, Yuichi Ishizaki, Megumi Ichikawa, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
  • 雑誌名: Biochemical Journal 巻: in press 号: 1 ページ: 145-158
  • DOI: 10.1042/bj20150261
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Enhancing thermostability and the structural characterization of Microbacterium saccharophilum K-1 β-fructofuranosidase. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yukari Ohta, Yuji Hatada, Yuko Hidaka, Yasuhiro Shimane, Keiko Usui, Tetsuya Ito, Koki Fujita, Gaku Yokoi, Marina Mori, Shona Sato, Takatsugu Miyazaki, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
  • 雑誌名: Applied Microbiology and Biotechnology 巻: (in press) 号: 15 ページ: 6667-6677
  • DOI: 10.1007/s00253-014-5645-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] GH63に属するグルコシダーゼの構造と基質特異性に関する新しい知見 (2013)
  • 著者名/発表者名: 宮崎 剛亜, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 雑誌名: 応用糖質科学 巻: 第3巻 ページ: 151-158
  • NAID: 220000139116
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of a glycoside hydrolase family 131 protein from Coprinopsis cinerea. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takatsugu Miyazaki, Makoto Yoshida, Mizuki Tamura, Yutaro Tanaka, Kiwamu Umezawa, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 587 号: 14 ページ: 2193-2198
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.05.041
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of a bacterial glycoside hydrolase family 63 enzyme in complex with its glycosynthase product, and insights into the substrate specificity. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takatsugu Miyazaki, Megumi Ichikawa, Gaku Yokoi, Motomitsu Kitaoka, Haruhide Mori, Yoshikazu Kitano, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
  • 雑誌名: FEBS Journal 巻: 280 号: 18 ページ: 4560-4571
  • DOI: 10.1111/febs.12424
  • 査読あり
• [学会発表] Pedobacter saltans 由来GH31 α-ガラクトシダーゼとリガンドとの複合体構造解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 宮崎 剛亜, 石嵜 雄一, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 日本農芸化学会2015年度大会
  • 発表場所: 岡山大学津島キャンパス（岡山市）
  • 年月日: 2015-03-28
• [学会発表] タンパク質の安定性におけるＮ結合型糖鎖が付加したアスパラギン残基の役割の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 宮崎 剛亜, 矢代 浩之, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 日本農芸化学会2015年度大会
  • 発表場所: 岡山大学津島キャンパス（岡山市）
  • 年月日: 2015-03-27
• [学会発表] α-ガラクトシダーゼ活性を示す新奇な細菌由来GH31グリコシダーゼのX線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 宮崎 剛亜, 市川 めぐみ, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会平成26年度大会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター（新潟市）
  • 年月日: 2014-09-24 – 2014-09-25
• [学会発表] Arthrobacter globiformis T-6由来イソマルトデキストラナーゼとパノースとの複合体の立体構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岡沢 唯香, 宮崎 剛亜, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 日本農芸化学会2014年度大会
  • 発表場所: 明治大学生田キャンパス(神奈川県川崎市)
  • 年月日: 2014-03-28
• [学会発表] Microbacterium saccharophilum K-1由来β-フルクトフラノシダーゼ耐熱化酵素の立体構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 盛 まりな, 横井 岳, 佐藤 祥名, 宮崎 剛亜, 大田 ゆかり, 嶋根 康弘, 秦田 勇二, 藤田 孝輝, 伊藤 哲也, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 日本農芸化学会2014年度大会
  • 発表場所: 明治大学生田キャンパス(神奈川県川崎市)
  • 年月日: 2014-03-28
• [学会発表] Arthrobacter globiformis T-6由来イソマルトデキストラナーゼの糖結合モジュールCBM35の構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岡沢 唯香, 横井 岳, 宮崎 剛亜, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 物構研サイエンスフェスタ2013
  • 発表場所: つくば国際会議場(茨城県つくば市)
  • 年月日: 2014-03-18
• [学会発表] Microbacterium saccharophilum由来β-フルクトフラノシダーゼ全長の構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 盛 まりな, 横井 岳, 佐藤 祥名, 宮崎 剛亜, 伊藤 哲也, 藤田 孝輝, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 物構研サイエンスフェスタ2013
  • 発表場所: つくば国際会議場(茨城県つくば市)
  • 年月日: 2014-03-18
• [学会発表] 担子菌Coprinopsis cinerea由来GH131タンパク質N末端ドメインのX線結晶構造解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 宮崎 剛亜, 田村 瑞, 田中 祐太郎, 梅澤 究, 吉田 誠, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会平成25年度大会
  • 発表場所: 鹿児島大学郡元キャンパス(鹿児島県鹿児島市)
  • 年月日: 2013-09-25
• [学会発表] Arthrobacter globtformis T-6由来イソマルトデキストラナーゼのX線結晶構造解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岡沢 唯香, 横井 岳, 宮崎 剛亜, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会平成25年度大会
  • 発表場所: 鹿児島大学郡元キャンパス(鹿児島県鹿児島市)
  • 年月日: 2013-09-25
• [学会発表] Conformational changes and substrate recognition of an uncharacterized glycosidase YgjK belonging to GH63 from Escherichia coil. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takatsugu Miyazaki, Megumi Ichikawa, Haruhide Mori, Motomitsu Kitaoka, Yoshikazu Kitano, Atsushi Nishikawa and Tonozuka Tonozuka.
  • 学会等名: 10th Carbohydrate Bioengineering Meeting
  • 発表場所: Prague, Czech Republic
• [学会発表] Thermus Thermophilus HB8由来グルコシル/マンノシルグリセリン酸分解酵素とリガンドとの複合体の構造解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 市川 めぐみ, 宮崎 剛亜, 吉田 裕美, 神鳥 成弘, 西河 淳, 殿塚 隆史
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)