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化合物アレイ型プラットフォームを用いたP450分子群の基質特異性解析法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 13J07508
研究種目

特別研究員奨励費

配分区分補助金
応募区分国内
研究分野 ケミカルバイオロジー
研究機関東北大学

研究代表者

守谷 崇  東北大学, 大学院薬学研究科, 特別研究員(DC2)

研究期間 (年度) 2013
研究課題ステータス 完了 (2013年度)
配分額 *注記
900千円 (直接経費: 900千円)
2013年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
キーワードシトクロムP450 / ハイスループットスクリーニング / 基質特異性解析
研究概要

本年度はこれまでに開発した2-アセチルベンゾフランを利用するシトクロムP450基質判別法(2-ABF法)と既存の基質結合スペクトル解析やLC/MS解析を組み合わせることで、迅速かつ網羅的なP450基質特異性解析システムの構築を検討した。具体的には、基質候補ライブラリーとして、当研究室所蔵の合成サンプルおよび試薬1053種類を用いて、巨大菌由来P450BM3および緑膿菌由来P450camの基質スクリーニングを検討した。まず、一次スクリーニングとして、これまでに開発した2-ABF法によりNAD(P)HからNAD(P)^+への変換を促進する小分子を検出した。次にヒットした化合物が基質として結合するかを確認するため、二次スクリーニングとして基質結合スペクトルの測定を行った。これらのスクリーニングにより絞り込まれた基質候補小分子に関しては、別途P450による酸化反応を行いLC/MSにより酸化生成物の解析を行った。連のスクリーニングの結果、P450により酸化される基質小分子を判別することに成功したが、自身は酸化されずにNAD(P)Hの消費のみを引き起こす偽陽性小分子が一次スクリーニングにおいて多数ヒットするということも分かった。
偽陽性小分子がヒットした原因として、還元酵素系によるNAD(P)Hの消費を促進する小分子と、自身は酸化されずにNAD(P)Hの消費のみを促進するアンカップリング反応を誘起する小分子の存在が考えられた。このような偽陽性小分子を効率よく除くために、還元酵素系のみ存在する条件で小分子を反応させた際のNAD(P)^+の検出と、アンカップリング反応に伴い生成する過酸化水素の検出を組み合わせた結果、偽陽性の低減に成功した。このように、開発した2-ABF法と過酸化水素検出法を組み合わせることで、P450基質のみを判定できるハイスループットスクリーニングシステムのプロトタイプを構築することに成功した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成25年度の目的として掲げた、約1000種類の化合物を用いた、基質スクリーニング法のプロトタイプの構築に成功したため。

今後の研究の推進方策

現在適用している過酸化水素検出法は、検出感度に改善の余地を残している。今後は、より検出感度の高い過酸化水素検出法を適用し、P450基質のみを判定できるハイスループットスクリーニングシステムを確立する。

報告書

(1件)
  • 2013 実績報告書
  • 研究成果

    (4件)

すべて 2013

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] An improved fluorogenic NAD(P)^+ detection method using 2-acetylbenzofuran : its origin and application2013

    • 著者名/発表者名
      Takashi Moriya, Ayano Kawamata, Yusuke Takahashi, Yoshiharu Iwabuchi and Naoki Kanoh
    • 雑誌名

      Chemical Communications

      巻: 49巻 号: 98 ページ: 11500-11502

    • DOI

      10.1039/c3cc47264g

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] 2,7-ナフチリジノン型蛍光色素の開発とシトクロムP450基質スクリーニングへの応用2013

    • 著者名/発表者名
      守谷崇、川又綾乃、高橋裕介、岩渕好治、叶直樹
    • 学会等名
      第43回複素環化学討論会
    • 発表場所
      岐阜県岐阜市
    • 年月日
      2013-10-17
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] NAD^+選択的プローブを用いてチトクロムP450の基質を網羅的に検出する2013

    • 著者名/発表者名
      守谷崇、川又綾乃、岩渕好治、叶直樹
    • 学会等名
      第24回万有仙台シンポジウム
    • 発表場所
      宮城県仙台市
    • 年月日
      2013-06-29
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] cytochrome P450の基質スクリーニングを指向したNAD(P)^+選択的プローブの開発2013

    • 著者名/発表者名
      守谷崇、川又綾乃、高橋裕介、岩渕好治、叶直樹
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第8回年会
    • 発表場所
      東京都文京区
    • 年月日
      2013-06-19
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書

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公開日: 2014-01-29   更新日: 2024-03-26  

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