タンパク質膜組み込み機構の構造基盤の解明

• 研究課題/領域番号: 13J08353
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 生物物理学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 熊崎 薫 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2015年度)
• 配分額: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円); 2015年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 2014年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 2013年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: タンパク質膜組み込み / YidC / X線結晶構造解析 / Ｘ線結晶構造解析 / ＹｉｄＣ

研究実績の概要

本研究では、タンパク質膜組み込み機構の構造基盤の解明のため、YidCの立体構造情報に基づいた機能解析を進めることを目指している。前年度までの研究から、YidCが分子内部に親水的なアミノ酸残基を多く含んだ溝をもち、その溝を介して基質タンパク質と相互作用することが明らかとなった。しかし、YidCの基質認識機構や、タンパク質膜組み込み機構のダイナミクスは不明のままであった。そこで本年度は、YidCとその基質タンパク質との複合体のX線結晶構造解析を行い、それらを明らかにすることを目指した。
YidCのC末端に基質タンパク質を融合させ、YidC-基質タンパク質の融合タンパク質として構造解析を行うことを試みた。アフィニティの低い二つのタンパク質の複合体の構造解析を行う際に、両者をリンカーを介して融合し、両者が相互作用しやすくするという手法は、有効な戦略の一つである（Kang et al., Nature, 2015）。基質タンパク質を融合させた際のトポロジーを考慮し、適したトポロジーをもつMscLを基質タンパク質として使用した。
YidC-MscLの融合タンパク質を大腸菌に過剰発現させ、界面活性剤ドデシルマルトシドにより可溶化し、Niアフィニティークロマトグラフィー、プロテアーゼによるHisタグの切断、ゲルろ過クロマトグラフィーという過程により精製した。精製タンパク質に対し、脂質キュービック相法による結晶化スクリーニングを行ったところ、結晶が得られ、大型放射光施設SPring-8にてX線回折実験を行ったところ、最大分解能7.0Åの回折データを得ることができた。しかし、得られた分解能のデータでの構造解析は非常に困難であり、得られたモデルの構造精密化を十分に行うことはできなかった。現在は、さらに高分解能のデータ取得を目指し、結晶化コンストラクトの最適化や結晶化条件の最適化を行っている。

現在までの達成度 (段落)

27年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

27年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] 7.Crystal Structures of SecYEG in Lipidic Cubic Phase Elucidate a Precise Resting and a Peptide-Bound State (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshiki Tanaka, Yasunori Sugano, Mizuki Takemoto, Takaharu Mori, Arata Furukawa, Tsukasa Kusakizako, Kaoru Kumazaki, Ayako Kashima, Ryuichiro Ishitani, Yuji Sugita, Osamu Nureki, Tomoya Tsukazaki
  • 雑誌名: Cell report 巻: 13 号: 8 ページ: 1561-1568
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2015.10.025
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Hydrophilic microenvironment required for the channel-independent insertase function of YidC protein. (2015)
  • 著者名/発表者名: Shimokawa-Chiba, N., Kumazaki, K., Tsukazaki, T., Nureki, O., Ito, K. and Chiba, S.
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 巻: 112 号: 16 ページ: 5063-5068
  • DOI: 10.1073/pnas.1423817112
  • NAID: 120005716850
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structural basis for Sec-independent membrane protein insertion by YidC. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kumazaki, K., Chiba, S., Takemoto, M., Furukawa, A., Nishiyama, K., Sugano, Y., Mori, T., Dohmae, N., Hirata, K., Nakada-Nakura, Y., Maturana, A.D., Tanaka, Y., Mori, H., Sugita, Y., Arisaka, F., Ito K., Ishitani, R., Tsukazaki, T. and Nureki, O.
  • 雑誌名: Nature 巻: 509 号: 7501 ページ: 516-520
  • DOI: 10.1038/nature13167
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystal structure of Escherichia coli YidC, a membrane protein chaperone and insertase (2014)
  • 著者名/発表者名: Kumazaki, K., Kishimoto, T., Furukawa, A., Mori, H., Tanaka, Y., Dohmae, N., Ishitani, R., Tsukazaki, T., and Nureki, O.
  • 雑誌名: Scientific reports 巻: 4 号: 1 ページ: 7299-7299
  • DOI: 10.1038/srep07299
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of YidC, a membrane-protein chaperone and insertase from Bacillus halodurans. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kumazaki, K., Tsukazaki, T., Nishizawa, T., Tanaka, Y., Kato, H.E., Nakada-Nakura, Y., Hirata, K., Mori, Y., Suga, H., Dohmae, N., Ishitani, R. and Nureki, O.
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications 巻: 70 号: 8 ページ: 1056-1060
  • DOI: 10.1107/s2053230x14012540
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] タンパク質膜組み込みに関わる膜タンパク質YidCのX線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 熊崎 薫, 千葉 志信, 武本 瑞貴, 古川 新, 伊藤 維昭, 石谷 隆一郎, 塚崎 智也, 濡木 理
  • 学会等名: 日本結晶学会 平成26年度年会
  • 発表場所: 東京大学農学部 (東京都, 文京区)
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [学会発表] タンパク質膜組み込みに関わる膜タンパク質YidCのX線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 熊崎 薫
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会
  • 発表場所: ワークピア横浜 (神奈川県, 横浜市)
  • 年月日: 2014-06-26 – 2014-06-28
  • 招待講演
• [学会発表] Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC (2014)
  • 著者名/発表者名: 熊崎 薫, 千葉 志信, 石谷 隆一郎, 塚崎 智也, 濡木 理
  • 学会等名: 第14回 東京大学 生命科学シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学本郷キャンパス (東京都, 文京区)
  • 年月日: 2014-04-26 – 2014-04-28
• [学会発表] Crystal Structure of YidC and a Mechanism of Membrane Protein Insertion (2014)
  • 著者名/発表者名: Kaoru Kumazaki
  • 学会等名: Gordon Research Conferences : Protein Transport Across Cell Membranes
  • 発表場所: アメリカ・ガルベストン
  • 年月日: 2014-03-09