ウシにおける凍結乾燥精子ならびにガラス化卵子由来の胚盤胞作製システムの構築

• 研究課題/領域番号: 13J10439
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: 応用動物科学
• 研究機関: 生理学研究所 (2014); 信州大学 (2013)
• 研究代表者: 原 弘真 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円); 2014年度: 900千円 (直接経費: 900千円); 2013年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: 凍結乾燥 / コラプス / 最大凍結濃縮相ガラス転移温度 / ガラス化保存 / 星状体 / ROCK阻害剤 (Y-27632) / α-トコフェロール / 回復培養 / ROCK阻害剤(Y-27632)

研究実績の概要

細胞の常温保存を可能にする凍結乾燥は、凍結保存に代わる新たな保存方法として注目されている。本研究では、凍結乾燥サンプルの構造崩壊である「コラプス」と呼ばれる現象に着目し、精子凍結乾燥条件の最適化を図った。示差走査熱量計測定により精子懸濁液の作製に広く用いられているEGTAバッファーの最大凍結濃縮相ガラス転移温度（Tg'）を測定したところ、-45℃という非常に低い温度であることがわかった。そこでEGTAバッファーからNaClを除去し、さらにトレハロースを添加することでTg'を-28℃に上昇させることに成功した。ウシ精子を懸濁したこの修正EGTAバッファーを予備凍結した後に-30℃で乾燥したところ、コラプスの形成が抑制され、ICSI後の発生率が有意に改善された。
続いて卵子のガラス化保存に関する研究においては、近年我々が報告した、ウシガラス化卵子で多発する星状体形成異常を改善することで、その発生能を改善することを目指した。ガラス化ウシ卵子の回復培養培地に抗酸化剤であるα-トコフェロールを添加して2時間培養したところ、体外受精後に星状体が複数形成されてしまう異常を示す前核期卵の割合が有意に低下した。さらに胚盤胞発生率について調べたところ、その値が無添加対照区と比べて高い値を示した。さらに本年度では、卵子の供給源であるウシ卵巣の冷蔵保存によって、そこから回収された卵子が体外受精後に同様の星状体形成異常を示すことも明らかとなり、成熟培養後の卵子にROCK阻害剤（Y-27632）処理を施すことで、この異常を抑制することに成功した。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] High revivability of vitrified-warmed bovine mature oocytes after recovery culture with α-tocopherol (2015)
  • 著者名/発表者名: Yashiro I, Tagiri M, Ogawa H, Tashima K, Takashima S, Hara H, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Reproduction 巻: 149 号: 4 ページ: 347-355
  • DOI: 10.1530/rep-14-0594
  • 査読あり
• [雑誌論文] Multiple aster formation is frequently observed in bovine oocytes retrieved from 1-day stored ovaries (2015)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Tagiri M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Cryobiology 巻: 未確定
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Adverse effect of cake collapse on the functional integrity of freeze-dried bull spermatozoa (2014)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Tagiri M, Hwang IS, Takahashi M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Cryobiology 巻: 68 号: 3 ページ: 354-360
  • DOI: 10.1016/j.cryobiol.2014.04.005
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Microtubule assembly and in vitro development of bovine oocytes with increased intracellular glutathione level prior to vitrification and in vitro fertilization (2014)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Yamane I, Noto I, Kagawa N, Kuwayama M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Zygote 巻: 22 号: 4 ページ: 476-482
  • DOI: 10.1017/s0967199413000105
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Derivation of embryonic stem cell lines from parthenogenetically developing rat blastocysts. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirabayashi M, Goto T, Tamura C, Sanbo M, Hara H, Kato-Itoh M, Sato H, Kobayashi T, Nakaushi H, Hochi S.
  • 雑誌名: Stem Cells and Development 巻: VOL.23 号: 2 ページ: 107-114
  • DOI: 10.1089/scd.2013.0200
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of Leukemia Inhibitory Factor and Forskolin on Establishment of Rat Embryonic Stem Cell Lines (2014)
  • 著者名/発表者名: Hirabayashi M, Goto T, Tamura C, Sanbo M, Hara H, Hochi S.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 60 号: 1 ページ: 78-82
  • DOI: 10.1262/jrd.2013-109
  • NAID: 130003381862
  • ISSN: 0916-8818, 1348-4400
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adverse effect of cake collapse on the functional integrity of freeze-dried bull suermatozoa. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Tagiri M, Hwang IS, Takahashi M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Cryobiology 巻: (印刷中)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rescue of vitrified-warmed bovine oocytes with Rho-associated coiled-coil kinase inhibitor. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hwang IS, Hara H, Chung HJ, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 雑誌名: Biology of Reproduction 巻: VOL.89 号: 2 ページ: 26-26
  • DOI: 10.1095/biolreprod.113.109769
  • 査読あり
• [学会発表] 保存卵巣由来のウシ前核期卵における星状体形成と胚盤胞発生との関係 (2014)
  • 著者名/発表者名: 原 弘真・田切 美穂・平林 真澄・保地 眞一
  • 学会等名: 第107回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 北海道・帯広市・帯広畜産大学
  • 年月日: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [学会発表] Effect of cake collapse on integrity of freeze-dried bull spermatozoa. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Tarigi M, Hirabayashi M, Hochi S.
  • 学会等名: 40th Annual Conference of the IETS
  • 発表場所: Hugget Hotel(アメリカ・ネバダ州・リノ)
  • 年月日: 2014-01-15
• [学会発表] 凍結乾燥ウシ精子の発生能に及ぼすコラプスの影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 原弘真、田切美穂、平林真澄、保地眞一
  • 学会等名: 第106回日本繁殖生物学会大会
  • 発表場所: 東京農工大学・農学部(東京都府中市幸町3-5-8)
  • 年月日: 2013-09-12
• [備考] 保地研究室ホームページ
  • URL: http://fiber.shinshu-u.ac.jp/hochi/