| 研究概要 |
(1)AP180のENTHドメインがPI(4,5)P_2に最も強く結合することを確認した。その後、epsinにおいて脂質結合に必須である63番Arg、76番Lysにそれぞれ相当する各残基、66番Arg、77番LysをAlaに置換すると、PI(4,5)P2結合能を失った。次に、AP180、CALM及びHip1Rの全長タンパクをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現すると、クラスリンと共局在する小胞状の構造が観察された。中でもHip1Rを含む小胞は、細胞膜直下においてアクチン繊維束に沿って分布することから、エンドサイトーシスとアクチン細胞骨格を結ぶキータンパクである可能性が示唆された。
(2)Epsinファミリーに属する新規タンパクKIAA0171の機能解析を行った。まず、ENTHドメインに対する各イノシトールリン脂質との結合アッセイを行ったところ、PI(4,5)P2に最も強く結合した。GFP融合タンパクをCOS7細胞内に発現したところ、その細胞内局在はクラスリン、およびTGN輸送に関与するアダプタータンパク、AP-1と一致し、その一部はMVB (multi-vesicular body)構造の周縁部に沿って局在することも観察された。次に、さまざまな変異型コンストラクトをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現し、その細胞内局在を検討した。ENTHドメインを欠損すると、KIAA0171のTGN周辺への局在は観察されず、細胞質中に分散する小胞状の局在を示した。脂質結合に必須の67番ArgをAlaに置換した変異体も同様の異常な局在パターンを示した。逆に、ENTHドメインのアミノ末端にミリスチン酸化シグナルを付加した膜結合型変異体ではTGN周辺への集積が促進された。さらに驚くべきことには、ENTHドメインのみをGFP融合タンパクとして発現させると単独でTGNに局在できることが観察され、その局在は67番Arg変異型ENTHドメインでは観察されなかった。
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