Pol III発現系を用いた哺乳動物細胞におけるRNA干渉の開発とがん治療への応用

• 研究課題/領域番号: 14030011
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 多比良 和誠 東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (10261778)
• 研究分担者: 宮岸 真 東京大学, 大学院・工学系研究科, 特任助教授 (30323538)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 49,700千円 (直接経費: 49,700千円); 2004年度: 15,000千円 (直接経費: 15,000千円); 2003年度: 19,700千円 (直接経費: 19,700千円); 2002年度: 15,000千円 (直接経費: 15,000千円)
• キーワード: ジーンディスカバリー / アポトシス / RNA干渉 / RNAiライブラリー / RNA interference / pol III系 / U6プロモーター / 遺伝子治療 / がん遺伝子 / polIII系

研究概要

本研究課題では、siRNA発現ベクター系の最適化および、高機能化を行うと共に、現在作製段階であるヒト遺伝子に対するsiRNAベクターライブリーを用いて、がんに関連する新規機能遺伝子の探索、シグナリングパスウェイの解析を行っている。
今年度は、昨年度までに開発してきたsiRNA発現システムを用いて、アポトシスに関与する遺伝子数百個に対して、siRNA発現ベクターライブラリーを作製し、アポトシスシグナルトランスダクションの解析を試みた。タプシガルジン添加による小胞体(ER)ストレス依存的なアポトシスに対して、スクリーニングを行った結果、これまで知られていたDR5-Caspase8の経路に加えて、E2F1-PUMAパスウェイ、MAP2K8-ERKパスウェイが関与していること、また、ミトコンドリアの上流に、これまで報告のあるBid以外にも、PUMA、Badなど他の、BH3-only proteinが関与していることが新たに明らかになった。また、これまで関与していると考えられていたCaspase3、Caspase9非依存的な経路の存在が示唆された。今回の解析結果は、我々が開発したsiRNAベクターライブラリーを用いたスクリーニングがシグナル経路を解明する上で非常に効果的であることを強く示唆しており、今後のさらにスケールアップしたsiRNA発現ライブラリーを用いた、様々ながん細胞および、様々なアポトシス経路における新規機能遺伝子の網羅的探索を行っていく予定である。また、アポトシスを抑制するsiRNAベクターだけではなく、逆にアポトシスを促進するsiRNAベクターのスクリーングも、がんの治療に直接的に応用できる可能性があるので、精力的に行っていきたいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Optimization of an siRNA-expression system with an improved hairpin and its significant suppressive effects in mammalian cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Miyagishi, M., Sumimoto, H., Miyoshi, H., Kawakami, Y., Taira, K.
  • 雑誌名: Journal of Gene Medicine 6 ページ: 715-723
• [雑誌論文] Know-how of RNA interference and its applications in research and therapy. (2004)
  • 著者名/発表者名: Wadhwa, R., Kaul, S.C., Miyagishi, M., Taira, K.
  • 雑誌名: Mutat.Res. 567 ページ: 71-84
• [雑誌論文] Use of a randomized hybrid ribozyme library for identification of genes involved in muscle differentiation. (2004)
  • 著者名/発表者名: Wadhwa, R., Yaguchi, T., Kaur, K., Suyama, E., Kawasaki, H., Taira, K., Kaul, S.C.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 51622-51629
• [雑誌論文] Identification of metastasis-related genes using a library of randomized ribozymes in a mouse model. (2004)
  • 著者名/発表者名: Suyama, E., Wadhwa, R., Kaur, K., Miyagishi, M., Kaul, S.C., Kawasaki, H., Taira, K.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 38083-38086
• [雑誌論文] Identification of a network involved in thapsigargin-induced apoptosis using a library of siRNA-expression vectors. (2004)
  • 著者名/発表者名: Futami, T., Miyagishi, M., Taira, K.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 826-831
• [雑誌論文] A20 is a negative regulator of interferon regulatory factor 3 signaling. (2004)
  • 著者名/発表者名: Saitoh, T., Yamamoto, M., Miyagishi, M., Taira, K., Nakanishi, M., Fujita, T., kira, S., Yamamoto, N., Yamaoka, S.
  • 雑誌名: Journal of Immunology 174 ページ: 1507-1512
• [文献書誌] Yoshinari, K, Miyagishi, M, Taira, K: "Effects on RNAi of structure, sequence and position within target RNA and potentially preferable sequence motif for siRNA activities in mammalian cells : Sequence itself rather than its location determines siRNA efficacy."Nucleic Acids Res.. 31. 691-666 (2004)
• [文献書誌] Taki, M., Kato, Y., Miyagishi, M., Takagi, Y., Taira, K.: "Small Interfering RNA Expression in Cells Based on an Efficiently Constructed Dumbbell-shaped DNA."Angew.Chem.Int.Ed.Engl.. (in press). (2004)
• [文献書誌] Miyagishi, M., Suminoto, H., Miyoshi, H., Kawakami, Y., Taira, K.: "Optimization of an siRNA-expression system with a mutated hairpin and its significant suppressive effects upon HIV vector-mediated transfer into mammalian cells."J.Gene Med.. (in press). (2004)
• [文献書誌] Miyagishi, M, Taira, K: "Strategies for generation of a stable siRNA-expression library directed against the human genome."Oligonucleotides. 13. 325-333 (2003)
• [文献書誌] Yokota, T., Sakamoto, N., Enomoto, N., Tanabe, Y., Miyagishi, M., Maekawa, S., Yi, L, Kurosaki, M., Taira, K., Watanabe, M., Mizusawa, H.: "Inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by synthetic and vector-derived small interfering RNAs."EMBO Rep.. 4. 602-628 (2003)
• [文献書誌] Onuki, R., Bando, Y., Suyama, E., Katayama, T., Kawasaki, H., Baba, T., Tohyama, M., Taira, K.: "Involvement of an RNA-dependent protein kinase(PKR) in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease."EMBO J.. 23. 959-968 (2003)
• [文献書誌] Miyagishi, M., Matsumoto, S., Futami, T., Akashi, H., Appasani, K., Takagi, Y., Sutou, S., Taira, K.: "In "RNAi technology", Appasani, K.(ed.), Cambridge University Press, Cambridge, UK."Generation of highly specific shRNAi expression libraries against entire human genome.(in press). (2004)
• [文献書誌] Makoto Miyagishi: "U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targetes gene expression in mammalian cells"Nature Biotechnol.. 20・5. 497-500 (2002)
• [文献書誌] Makiko Hamada: "Effects on RNA interference in gene expression (RNAi) in cultured mammalian cells of mismatches and the introduction of chemical modifications at the 3' ends of siRNAs"Antisense Nucl. Acid Drug Develop.. 12・5. 301-309 (2002)
• [文献書誌] Hiroaki Kawasaki: "Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNAVal promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells"Nucleic Acids Res.. 31. 700-707 (2003)
• [文献書誌] Takashi Futami: "Effects of an RNA helicase-recruiting sequence indirectly attached to antisense molecules"Antisense Nucl. Acid Drug Develop.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Hiroaki Kawasaki: "siRNAs generated by recombinant human Dicer induce specific and significant but target site-independent gene silencing in human cells"Nucleic Acids Res.. 31・3. (2003)
• [文献書誌] Makoto Miyagishi: "Comparative analysis of suppressive effects of antisense, ribozyme and RNA interference in mammalian cells"Antisense Nucl. Acid Drug Develop.. (in press). (2003)