染色体複製のライセンス化と細胞周期制御の解明―CDT1を中心に―

• 研究課題/領域番号: 14033234
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 西谷 秀男 九州大学, 大学院・医学研究院, 助手 (40253455)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 4,800千円 (直接経費: 4,800千円); 2003年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円); 2002年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
• キーワード: 複製 / ライセンス化 / 分解 / Cdtl / Geminin / CyclinA / 染色体 / Cdt1

研究概要

細胞周期において、染色体の複製が正確に一回のみ行われることにより遺伝情報が維持される。我々は、複製のライセンス化に関わる因子Cdt1に焦点を当てその制御機構の研究を行ってきた。
(1)Cdt1のドメイン解析
Cdt1をN末、C末から削った変異体を作製し、Gemininや各種CDK-Cyclinの結合、核移行シグナルの存在領域の決定を行った。その結果、(a)GemininはCdt1の中程に結合する。(b)Cdt1は、CyclinAとは結合するが、CyclinBおよびCyclinEとは結合しない。CyclinAは、N末領域と結合する。(c)N末に核移行シグナルが存在する。ことを明らかにした。
(2)Cdt1の分解制御と高発現の効果
Cdt1のN末(1-189)・C末(160-end)を発現する細胞株を作製し、S期でのタンパク質の安定性を調べることにより、N末が分解に関与することを明らかにした。安定なC末を293T細胞に高発現すると、4C以上のDNA含量をもつ細胞が高頻度で出現した。従って、Cdt1の高発現が、再複製をもたらすことが示唆された。また、Cdt1がGeminin非依存的に分解されることをより明確にするため、siRNAによりGemininをサイレンス化した状態でも、ユビキチン-プロテアソーム系で分解されることを証明した。
(3)cdtl結合因子の検索
2ハイブリッド法により、Geminin,MCM6に加え4つの因子を同定した。また、Flag-Cdtlを安定に発現している細胞を作製し、Flag-Cdtlタンパク質を免疫沈降して、共沈する物を調べた。Gemininと思われる30kdaの主バンドに加え、20 35 45 47kdaのバンドが優位に検出された。これらのタンパク質のアミノ酸配列の決定を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Nishitani H.et al.: "DNA Replication Licensing"Frontier Bioscience. In press.
• [文献書誌] Seino H.et al.: "Two ubiquitin-conjugating enzymes, UbcP1/Ubc4 and UbcP4/Ubc11, have distinct functions for ubiquitination of mitotic cyclin"Mol Cell Biol. 23. 3497-3505 (2003)
• [文献書誌] Nishijima H.et al.: "Caffeine mimics adenine and 2'-deoxyadenosine, both of which inhibit the guanine-nucleotide exchange activity of RCC1 and the kinase activity of ATR."Genes Cells.. 8. 423-435 (2003)
• [文献書誌] Takahashi T.et al.: "ORC- binding sites are required for efficient MCM loading and origin firing in fission yeast"EMBO J.. 22. 964-974 (2003)
• [文献書誌] Umeda M.et al.: "A novel nuclear protein, Twa1, and Muskelin comprise a complex with RanBPM."Gene. 303. 47-54 (2003)
• [文献書誌] Niahitani H, Z.Lygerou: "Control of DNA replication licensing in a cell cycle"Genes to Cells. 7. 523-534 (2002)
• [文献書誌] Rao M.et al.: "A nuclear protein that interacts with and regulates transcriptional activity of androgen receptor and glucocorticoid receptor"J Biol Chem.. 277. 48020-48027 (2002)
• [文献書誌] Umeda M et al.: "A novel nuclear protein, Twal, and Muskelin comprise a complex with RanBPM"Gene. 303. 47-54 (2003)
• [文献書誌] Takahashi T.et al.: "Multiple ORC-binding sites are requited for efficient MCM loading and origin firing in fission yeast"EMBO J.. 22. 967-974 (2003)