リボザイムを利用した胚性幹細胞における未分化維持遺伝子のスクリーニング

• 研究課題/領域番号: 14035216
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 佐藤 充治 東京大学, 医科学研究所, 助手 (40332621)
• 研究分担者: 吉田 進昭 東京大学, 医科学研究所, 教授 (10250341)
• 研究期間 (年度): 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円); 2002年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
• キーワード: ES細胞 / リボザイム / siRNA / RNAi / レトロウイルスベクター / 未分化状態

研究概要

マウス胚性幹細胞(ES細胞)は、in vitroでの培養が可能な多能性幹細胞である。しかし、その多能性維持を可能にしている細胞内機構に関しては不明な点が多く、マウス以外の動物種におけるES細胞の培養も困難を極めている。そこで我々は、マウスES細胞における、多能性維持機構を解明するために、リボザイムあるいはRNAi活性を利用した網羅的な遺伝子のスクリーニング法を確立し、ES細胞の多能性維持に必須の分子の同定を試みることにした。
ES細胞へのリボザイム、siRNAの導入にはレトロウイルスベクターを用いることにした。ES細胞は、非常にわずかな培養条件の変化により容易に分化が誘導されてしまうことから、ベクターの導入方法の十分な検討が必要であった。パッケージングの方法についていくつかのパッケージング細胞を用いて検討を行った結果、ES細胞を未分化状態に保ったまま10^6IU/mlの高効率でベクターを導入できる条件の設定に成功した。次に、コントロールの標的遺伝子として、GFPを発現するES細胞を作製し、GFPに対するリボザイムを設計して、GFPの発現に対する影響を調べたが、用いたいくつかのリボザイムではGFPの発現低下をおこすことができなかった。リボザイムの設計にはいくつかの制約があり、標的配列の設計の自由度が低いことから、RNAi活性を利用することに方針変更した。siRNAの発現にはH1RNAのプロモーターを利用することにし、siRNAを細胞内で発現させるためのユニットを構築した。これをレトロウイルスベクターに導入し、GFPを発現するES細胞のほか、ルシフェラーゼを発現するES細胞を作製し、それぞれの発現に対するsiRNA発現の影響を検討している。また、ES細胞内に導入したsiRNAの発現ユニット中のDNA配列をひとつのコロニーからPCRを用いて回収するための条件設定にも成功し、現在ランダムな配列をもつsiRNAライブラリーの構築を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Nosaka, T., Morita, S., Kitamura, H., Nakajima, H., Shibata, F., Morikawa, Y., Kataoka, Y., Ebihara, Y., Kawashima, T., Itoh, T., Ozaki, K., Senba, E., Tsuji, K., Makishima, F., Yoshida, N., Kitamura, T.: "Mammalian Twisted gastrulation is essential for skeleto-lymphogenesis"Mol. Cell. Biol.. (in press).
• [文献書誌] Sato, A., Matsumoto, Y., Koide, U., Kataoka, Y., Yoshida, N., Yokota, T., Asashima, M., Nishinakamura, R.: "Zinc finger protein sall2 is not essential for embryonic and kidney development"Mol. Cell. Biol.. 23. 62-69 (2003)
• [文献書誌] Fukuda, T., Yoshida, N., Kataoka, Y., Manabe, R., Mizuno-Horikawa, Y., Sato, M., Kuriyama, K., Yasui, N., Sekiguchi, K.: "Mice lacking the EDB segment of fibronectin develop normally but exhibit reduced cell growth and fibronectin matrix assembly in vitro"Cancer Res.. 62. 5603-5610 (2002)
• [文献書誌] Honke, K., Hirahara, Y., Dupree, J., Suzuki, K., Popko, B., Fukushima, K., Fukushima, J., Nagasawa, T., Yoshida, N., Wada, Y., Taniguchi, N.: "Paranodal junction formation and spermatogenesis require sulfoglycolipids"Proc. Natl. Acad. Sci.. 99. 4227-4232 (2002)
• [文献書誌] Ohtsuka, S., Takaki, S., Iseki, M., Miyoshi, K., Nakagata, N., Kataoka, Y., Yoshida, N., Takatsu, K., Yoshimura, A.: "SH2-B is Required for both Male and Female Reproduction"Mol. Cell. Biol.. 22. 3066-3077 (2002)
• [文献書誌] Fukuyama, H., Adachi, M., Suematsu, S., Miwa, K., Suda, T., Yoshida, N., Nagata, S.: "Requirement of Fas expression in B cells for tolerance induction"Eur. J. Immunol.. 32. 223-230 (2002)