発光試薬による超高感度核酸解析手法の開発

• 研究課題/領域番号: 14102031
• 研究種目: 基盤研究(S)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 物理系薬学
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 甲斐 雅亮 長崎大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 教授 (00160953)
• 研究分担者: 椛島 力 長崎大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 助教授 (20274673) ; 太田 和子 (大田 和子) 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (20039647)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 105,040千円 (直接経費: 80,800千円、間接経費: 24,240千円); 2006年度: 9,750千円 (直接経費: 7,500千円、間接経費: 2,250千円); 2005年度: 9,750千円 (直接経費: 7,500千円、間接経費: 2,250千円); 2004年度: 18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円); 2003年度: 23,920千円 (直接経費: 18,400千円、間接経費: 5,520千円); 2002年度: 43,550千円 (直接経費: 33,500千円、間接経費: 10,050千円)
• キーワード: デキストランプローブ / 超高感度検出 / 核酸プローブ / DNA解析 / 技術開発 / 化学発光 / 高分子プローブ / 発光プローブ / 発光試薬 / 核酸 / 高分子化合物 / プローブ / 解析

研究概要

本研究の目的は、新規の超高感度水溶性高分子プローブを創製し、検体である核酸をPCRによってコピーすることなく、細胞内のゲノムDNA或いはmRNA発現量を、マイクロアレイチップやサザンプロット膜上で、網羅的に高感度検査できる手法を構築することである。そこで、本研究課題について研究し、以下の研究成果を得た。
(1)新規化学発光性デキストラン高分子の創製とDNAアレイチップ検査法:高発光量子収率を示すルミノールなどの低分子量発光物質をデキストランに多数結合させ、かつビオチンも結合させた発光性高分子プローブの合成法を確立した。それにより、世界最高の発光強度を示す約3000個のルミノール並びに約300個のビオチンを導入した化学発光性デキストラン高分子を合成し、検出用プローブとして用いた。次に、安価なナイロン膜上に作成したターゲットDNAアレイに対して、相補的なビオチン化cDNAをハイブリダイズさせたのち、デキストラン高分子プローブを、アビジンを介して連鎖的に結合させた結果、従来法よりも高感度なテロメアDNAの定量的画像検出法を開発できた。
(2)化学発光性核酸高分子形成によるcDNAアレイチップ検査法:テロメアDNAのcDNAアレイに、検体であるテロメアDNAとハイブリダイズさせたのち、ビオチン化長鎖DNA(鮭精子、分子量10^9以上)とアビジンとの結合によるシグナル増幅について検討した。その結果、ターゲットDNAに長鎖DNAを連鎖結合させることに成功し、TMPG反応による検出感度を約1000倍高めることができた。この感度は、上述の方法よりも、10倍ほど高感度であったが、プローブとして用いた鮭精子DNAが、ある程度、cDNAやテロメアDNA自体に結合していることが分かった。現在、原核細胞由来の長鎖DNAを発光増幅プローブとして作成し、この検査法について再検討している。

研究成果

• [雑誌論文] Facile determination of DNA-binding nuclear factor-kB by chemiluminescence detection (2007)
  • 著者名/発表者名: Keiko Tonooka(その他3名共著)
  • 雑誌名: Anal. Biochem. 364 ページ: 30-36
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Facile determination of DNA-binding nuclear factor-KB by chemiluminescence detection. (2007)
  • 著者名/発表者名: K.Tonooka, T.Kabashima, M.Yamasuji, M.Kai
  • 雑誌名: Anal. Biochem. 364 ページ: 30-36
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Facile determination of DNA-binding nuclear factor-kB by chemiluminescence detection (2007)
  • 著者名/発表者名: Keiko Tonooka
  • 雑誌名: Anal.Biochem. (In press 3月9日現在)
• [雑誌論文] Chemiluminescence detection of amino acids using an Edman-type reagent, 4-(1'-cyanoisoindolyl)phenylisothio cyanate (2005)
  • 著者名/発表者名: Masaaki Kai(その他5名共著)
  • 雑誌名: Anal.Chim.Acta 535 ページ: 153-159
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Magnetic bead-based label-free chemiluminescence detection of specific DNA sequence-telomere (2005)
  • 著者名/発表者名: Zhi-Juan Cao(その他3名共著)
  • 雑誌名: Acta Chim. Sinica 63 ページ: 407-410
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Chemiluminescence detection of amino acids using an Edman-type reagent, 4-(1'-cyanoisoindolyl) phenylisothiocyanate. (2005)
  • 著者名/発表者名: M.Kai, M.Morizono, M.N.Wainaina, T.Kabashima, M.K.Lee, J.Lu
  • 雑誌名: Anal. Chim. Acta 535 ページ: 153-159
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Magnetic bead-based label-free chemiluminescence detection of specific DNA sequence-telomere. (2005)
  • 著者名/発表者名: Z.-J.Cao, Y.Xia, M.Kai, J.Lu
  • 雑誌名: Acta Chim. Sinica 63 ページ: 407-410
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Chemiluminescence detection of amino acids using an Edman-type reagent,4-(1'-cyanoisoindolyl)phenylisothiocyanate (2005)
  • 著者名/発表者名: Masaaki Kai
  • 雑誌名: Anal.Chim.Acta 535 ページ: 153-159
• [雑誌論文] Chemiluminescence determination of tetracycline based on radical production in a basic acetonitrile-hydrogen peroxide reaction (2004)
  • 著者名/発表者名: Choiwan Lau(その他2名共著)
  • 雑誌名: Anal. Chim. Acta 503 ページ: 235-239
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Enantio-selective inhibition of (1R,9S )-and (1S,9R )-β-hydrastines on dopamine biosynthesis in PC12 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Shou Yu Yin(その他8名共著)
  • 雑誌名: Neuropharmacol. 47 ページ: 1045-1052
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Chemiluminescence determination of tetracycline based on radical production in a basic acetonitrile-hydrogen peroxide reaction. (2004)
  • 著者名/発表者名: C.Lau, J.Lu, M.Kai
  • 雑誌名: Anal. Chim. Acta 503 ページ: 235-239
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Enantio-selective inhibition of (1R,9S )-and (1S,9R)-β-hydrastines on dopamine biosynthesis in PC12 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: S.Y.Yin, Y.M.Kim, J.J.Lee, C.M.Jin, Y.J.Yang, J.J.Ma, M.H.Kang, M.Kai, M.K.Lee
  • 雑誌名: Neuropharmacol. 47 ページ: 1045-1052
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Chemiluminescence determination of tetracycline based on radical production in a basic acetonitrile-hydrogen peroxide reaction (2004)
  • 著者名/発表者名: Choiwan Law
  • 雑誌名: Anal.Chim.Acta 503 ページ: 235-239
• [雑誌論文] Enantio-selective inhibition of (1R,9S)-and (1S,9R)-β-hydrastines on dopamine biosynthesis in PC 12 cell (2004)
  • 著者名/発表者名: Shou Yu Yin
  • 雑誌名: Neuropharmacol. 47 ページ: 1045-1052
• [雑誌論文] Effects of (1R,9S)-β-hydrastine on L-DOPA-induced cytotoxicity in PC12 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Shou Yu Yin
  • 雑誌名: Euro.J.Pharm. 488 ページ: 71-77
• [雑誌論文] Xylulose 5-phosphate mediates glucose-induced lipogenesis by xylulose 5-phosphate-activated. protein phosphatase in rat liver (2003)
  • 著者名/発表者名: Tsutomu Kabashima(その他3名共著)
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 ページ: 5107-5112
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Chromatographic determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by means of fluorescence, chemiluminescence and mass spectrometry (2003)
  • 著者名/発表者名: Masaaki Kai(その他2名共著)
  • 雑誌名: Talanta 60 ページ: 325-334
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Magnetic bead-based label-free chemiluminescence detection of telomeres (2003)
  • 著者名/発表者名: Jianzhong Lu(その他2名共著)
  • 雑誌名: Chem. Commun. 2003 ページ: 2888-2889
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Sensitive determination of a β-lactam antibiotic, cefaclor by liquid chromatography with chemiluminescence detection (2003)
  • 著者名/発表者名: Masaaki Kai(その他5名共著)
  • 雑誌名: J. Pharm. Biomed. Anal. 30 ページ: 1765-1771
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A simple and sensitive chemiluminescence method for the determination of tiopronin for a pharmaceutical formulation (2003)
  • 著者名/発表者名: Jianzhong Lu(その他4名共著)
  • 雑誌名: J. Pharm. Biomed. Anal. 33 ページ: 1033-1038
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Xylulose 5-phosphate mediates glucose-induced lipogenesis by xylulose 5-phosphate-activated protein phosphatase in rat liver. (2003)
  • 著者名/発表者名: T.Kabashima, T.Kawaguchi, B.E Wadzinski, K.Ueda
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 ページ: 5107-5112
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Chromatographic determinations of a 6-lactam antibiotic, cefaclor by means of fluorescence, chemiluminescence and mass spectrometry. (2003)
  • 著者名/発表者名: Masaaki Kai, Hiromi Kinoshita, Mikio Morizono
  • 雑誌名: Talanta 60 ページ: 325-334
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Magnetic bead-based label-free chemiluminescence detection of telomeres. (2003)
  • 著者名/発表者名: J.Lu, C.Lau, M.Kai
  • 雑誌名: Chem. Commun. ページ: 2888-2889
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Sensitive determination of a β-lactam antibiotic, cefaclor by liquid chromatography with chemiluminescence detection. (2003)
  • 著者名/発表者名: M.Kai, H.Kinoshita, K.Ohta, S.Hara, M.K.Lee, J.Lu
  • 雑誌名: J. Pharm. Biomed. Anal. 30 ページ: 1765-1771
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A simple and sensitive chemiluminescence method for the determination of tiopronin for a pharmaceutical formulation. (2003)
  • 著者名/発表者名: J.Lu, C.Lau, S.Yagisawa, K.Ohta, M.Kai
  • 雑誌名: J. Pharm. Biomed. Anal. 33 ページ: 1033-1038
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Controlled kinetics of non-enzymatic chemiluminescence reactions for simple imaging of DNA and protein (2002)
  • 著者名/発表者名: Choiwan Lau(その他3名共著)
  • 雑誌名: Anal. Bioanal. Chem. 374 ページ: 1064-1068
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Simple chemiluminescence method for determination of mercaptopurine (2002)
  • 著者名/発表者名: Choiwan Lau(その他4名共著)
  • 雑誌名: Anal. Sci. 18 ページ: 1043-1045
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Simple and convenient chemiluminescence method for the determination of melatonin (2002)
  • 著者名/発表者名: Jianzhong Lu(その他2名共著)
  • 雑誌名: Anal. Chim. Acta 455 ページ: 193-198
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Controlled kinetics of non-enzymatic chemiluminescence reactions for simple imaging of DNA and protein. (2002)
  • 著者名/発表者名: C.Lau, J.Lu, T.Yamaguchi, M.Kai
  • 雑誌名: Anal. Bioanal. Chem. 374 ページ: 1064-1068
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Simple chemiluminescence method for determination of mercaptopurine. (2002)
  • 著者名/発表者名: C.Lau, J.Lu, S.Yagisawa, K.Ohta, M.Kai
  • 雑誌名: Anal. Sci. 18 ページ: 1043-1045
  • NAID: 10011311230
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Simple and convenient chemiluminescence method for the determination of melatonin (2002)
  • 著者名/発表者名: J.Lu, C.Lau, M.K.Lee, M.Kai
  • 雑誌名: Anal. Chim. Acta 455 ページ: 193-198
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] ベーシック分析化学 (第16章 タンパク質と核酸の標識) (2006)
  • 著者名/発表者名: 甲斐雅亮, 椛島 力(その他15名共著)
  • 総ページ数: 260
  • 出版者: 化学同人
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] 薬理物理化学-第4版-(第7章 界面とコロイド)(松島美一, 吉柳節夫監修) (2004)
  • 著者名/発表者名: 甲斐 雅亮(共著)
  • 総ページ数: 362
  • 出版者: 廣川書店株式会社
• [産業財産権] LUMINESCENT POLYMER AND USE THEREOF IN BIOASSAY (2002)
  • 発明者名: MASAAKI KAI
  • 権利者名: MASAAKI KAI DIICHI KAGAKU YAKUHIN
  • 出願年月日: 2002-09-19
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masaaki Kai: "Sensitive determination of a β-lactam antibiotic, cefaclor by liquid chromatography with chemiluminescence detection"J.Pharm.Biomed.Anal.. 30. 1765-1771 (2003)
• [文献書誌] Masaaki Kai: "Chromatographic determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by means of fluorescence, chemiluminescence and mass spectrometry"Talanta. 60. 325-334 (2003)
• [文献書誌] Jianzhong Lu: "Magnetic bead-based label-free chemiluminescence detection of telomeres"Chem.Commun.. 2003. 2888-2889 (2003)
• [文献書誌] Jianzhong Lu: "A simple and sensitive chemiluminescence method for the determination of tiopronin for a pharmaceutical formulation"Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 33. 1033-1038 (2003)
• [文献書誌] Choiwan Lau: "Chemiluminescence determination of tetracycline based on radical production in a basic acetonitrile-hydrogen peroxide reaction"Anal.Chim.Acta. 503. 235-239 (2004)
• [文献書誌] 甲斐 雅亮 (共著): "分析試料前処理ハンドブック(中村 洋 監修)"丸善株式会社. 1053 (2003)
• [文献書誌] Choiwan Lau: "Simple Chemilumine scence Method for the Determination of Mercaptopurine"Analytical Scienes. 18. 1043-1045 (2002)
• [文献書誌] De-Qi Yuan: "The first successful investigation into a cyclo dextrin-based enzymemodel asanefficient catalyst of luminol"Chem. Commum.. 730-731 (2002)
• [文献書誌] Choiwan Lau: "Controlled kinetics of non-enzymatic chemiluminescence reactions for simple imaging of DNA and protein"Anal. Bioanal. Chem.. 374. 1064-1068 (2002)
• [文献書誌] Jianzhong Lu: "Simple and convenient chemiluminescence method for the determination of melatonin"Analytica Chimica Acta. 455. 193-198 (2002)
• [文献書誌] Masaaki Kai: "senstive determination of a D-lactam antibiotic, cefaclor by liquid chromatography with chemiluminescence"J. Pharm. Biomod. Anal.. 30. 1765-1771 (2003)