研究課題
基盤研究(A)
生体組織の凍結保存を成功させるには、凍結時に細胞の内外に生成する氷晶による致命的な損傷(凍害)を抑止する必要がある。そのだめ、凍結過程での冷却速度を最適に制御すると同時に、凍害防御剤の速切な選定によって氷核の生成・成長を抑制することが行われている。凍結保存の一連の過程を通じて、細胞の生存を支配する現象には、(1)浸透圧ストレス(細胞の過膨張・過収縮)、(2)細胞内凍結、(3)細胞外で生成した氷晶による力学的ストレス、(4)生化学毒性、などがある。理想的な凍害防御剤とは、これらすべてを回避できる勢力をもつものと考えられる。本研究の第一の目的は、上記(1)〜(4)を回避しうる凍害防御剤を選定し、さらに電場などを用いた能動的方法によって高濃度の凍害防御剤を速やかに細胞内に取り込み、緩慢冷却速度でのガラス化(非晶質状態での固化)を実現して、上記(2)の凍害を抑止することである。第二の目的はj凍結過程および凍結後の細胞の活性評価法(viability assessment)の確立である。本研究では、超音波を用いた組織・細胞の力学的特性の計測や、蛍光反応を利用した細胎内のアデノシン3燐酸(ATP)の定量などを試みた。これら2テーマに関する本年度の研究成果の概略は以下のとおりである。テーマ1について:上に述べた諸条件を満足する凍害防御剤を選定する目的で、これまで使用してきたグリセロール、ジメチルスルフォキシド(DMSO)に加えて、アルギン酸、トレハロースおよびとれらの混合物について実験を行った。試料細胞としては、取り扱いが容易であることから主としてヒト由来の浮遊細胞を用いた。実験の結果、アルギン酸は低濃度で高粘性であるため、細胞膜の形状を維持する機能があること、トレハロースは細胞外に微細な氷晶をつくり、細池内に取り込まれなくても細胎内凍結を抑制する効果をもつことがわかった。なお、電場印加による高濃度凍害防御剤の細胞内導入についての実験も行い、ある程度満足すべき結果を得たが、印加の最適条件な明らかにするには至っていない。テーマ2について:微小な生体組織の「やわらかさ」を測定することによって、組織の活性を評価する方法の確立を目指して、超音波パルス法による軟組織の力学的測定法を開発した。また、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光強度の測定により、細胎内のATP量を測定して細胞の生存率を求める方法を開発した。
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