| 研究課題/領域番号 |
14208080
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物物理学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
上田 卓也 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (80184927)
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| 研究分担者 |
上田 宏 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助教授 (60232758)
富田 野乃 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 助手 (80323450)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
50,700千円 (直接経費: 39,000千円、間接経費: 11,700千円)
2004年度: 14,040千円 (直接経費: 10,800千円、間接経費: 3,240千円)
2003年度: 15,080千円 (直接経費: 11,600千円、間接経費: 3,480千円)
2002年度: 21,580千円 (直接経費: 16,600千円、間接経費: 4,980千円)
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| キーワード | 生体外蛋白質合成系 / 進化工学 / 蛋白質相互作用 / リボソーム / 終結因子 / 翻訳開始 / 開始因子 |
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| 研究概要 |
リボソームディスプレー法(RD法)を行う場合、リボソーム三者複合体の形成効率が極めて重要なポイントとなる。そこでまず、形成効率に影響するC末端側コンストラクトの検討を行った。HyHEL10scFv(リソチーム特異的抗体)の下流のスペーサー配列Gene[]のC末端側に、リボソーム内部で翻訳アレストを起こすと報告されているSecMのアレスト配列FXXXXWIXXXXGIRAGPを導入することで、RDにおけるmRNAの効率が上昇するという新しい知見を得るに至った。これはSecM導入によるリボソーム複合体の形成効率向上によるものであると考えられ、特にPURESYSTEMではSecMのストールを不安定化するtmRNAなどが存在しないため有効な方法であると推測された。また、PURESYSTEMは因子の有無など環境を自由に設計できるため、これまでの細胞抽出系を用いた場合では不可能であったシステムの詳細な素過程解析を行うことが可能である。「mRNA-リボソームー蛋白質複合体」の形成に必須な各因子(EF、リボソーム、mRNA)をRD系中から出し入れし、HyHEL10とDHFRとの1:30からのセレクション(リガンドとしてリソチームを使用)を行ったところ全ての因子が存在する場合にのみ、HyHEL10の特異的選択がみられ、「mRNA-リボソームー蛋白質複合体による目的分子の特異的選択」というRD法の基本概念を、PURESYSTEMを用いることで実験的に確認することが出来た。さらに、scFvの特異的選択系において、細胞抽出液の無細胞蛋白質合成系を用いた場合よりもPURESYSTEMを用いた場合の方が、高効率に選択されることを実験的に確認した。また、本方法では1ラウンドのセレクションにおいて、目的分子を12000倍以上に濃縮できることを確認してる。これまで報告されているRD法では1000倍以下の濃縮効率であるので、これは本方法の有効性を示すものであると考えられる。
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