加速進化型ガレクチンの糖鎖精密認識機能の解明と生命工学への応用

• 研究課題/領域番号: 14360045
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用微生物学・応用生物化学
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 小川 智久 東北大学, 大学院・生命科学研究科, 助教授 (80240901)
• 研究分担者: 村本 光二 東北大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (90157800) ; 西田 芳弘 名古屋大学, 工学研究科, 助教授 (80183896) ; 白井 剛 生物分子工学研究所, 情報解析研究部門, 主任研究員 (00262890)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 14,600千円 (直接経費: 14,600千円); 2004年度: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円); 2003年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円); 2002年度: 8,500千円 (直接経費: 8,500千円)
• キーワード: ガレクチン / Congerin / アポトーシス / 糖鎖認識 / レクチン / 糖鎖 / グライコーム / T細胞 / 加速進化 / グライコ-ム / 精密糖鎖認識

研究概要

本研究は、加速進化により異なる糖鎖認識能をもつマアナゴ体表粘液由来ガレクチン、Con1およびCon2について、その糖鎖認識能に着目し、コンジェリンの糖鎖認識機構と構造との詳細な相関を明らかにし、より高度な特異性をもつレクチン分子の設計法につながるレクチンの厳密な糖鎖特異性についての構造基盤を明らかにすることを目的にしている。そのためCon1およびCon2の加速進化によるアミノ酸置換がみられた糖鎖認識部位周辺の残基を相互に置換した変異体31種を調製し(Tableに大腸菌からのリコンビナントの収量とともに示した)、34種のピリジルアミノ(PA)化糖鎖に対するアフィニティーをフロンタルアフィニティー法による網羅的な変異解析を行った(合計31×34=1054通りの解離定数Kd値を求め、解析した)。その結果、(S50N)ConII、(E74Q)ConIIおよび(T107N)ConIIでは、共通の糖鎖構造(Galβ1-3GalNAc-)をもつGA1、GM1、GD1b、LNTなどの糖鎖への結合能が顕著に増加していた。また、(T77K)ConIでは、シアル酸を含む糖鎖に対する結合能が増強していた。全体的な糖鎖結合能に対するCongerinの構造要素として、Val68Asn, Gln71Glu, Gln72Thr, Glu74Gln, Thr107Asnの変異が関与し、特にGln72Thrが大きく影響していることが判明した。また、作成した変異体の糖鎖解析のためのツールとしての応用性についてヒト白血病由来Jurkat細胞に対するアポトーシス活性を指標にして併せて検討したところ、アポトーシス誘導活性は糖結合能の変化と明らかな相関をしめした。
このように、これら変異体の構造活性相関により、より強い特異性をもつ変異体のデザイン・開発への有用な情報を与え、Congerinのアポトーシス誘導能のメカニズム(ターゲットとなる受容体)を解析する上で有用な変異体を与えた。

研究成果

• [雑誌論文] Molecular diversity and accelerated evolution of C-type lectin-like proteins from snake venom. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, T., Chijiwa, T., Oda-Ueda, N., Ohno, M.
  • 雑誌名: Toxicon 45 ページ: 1-14
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] In Vitro Evolutionary Thermostabilization of Congerin II : A Limited Reproduction of Natural Protein Evolution by Artificial Selection Pressure. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shionyu-Mitsuyama C et al.
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 347(2) ページ: 385-397
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Acid Hydrolysis of Protein in a Microcapillary Tube for the Recovery of Tryptophane. (2005)
  • 著者名/発表者名: Adebiyi, A.P., Jin, D.-H., Ogawa, T., Muramoto, K.
  • 雑誌名: Bioscience Biotechnology and Biochemistry 69(1) ページ: 255-257
  • NAID: 130000030587
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] In vitro evolutionary thermostabilization of congerin II : a limited reproduction of natural protein evolution by artificial selection pressure. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shionyu-Mitsuyama C, Ito Y, Konno A, Miwa Y, Ogawa T, Muramoto K, Shirai T.
  • 雑誌名: J.Mol.Biol. 347(2) ページ: 385-397
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Acid Hydrolysis of Protein in a Microcapillary Tube for the Recovery of Tryptophane. (2005)
  • 著者名/発表者名: Adebiyi, A.P., Jin, D.-H., Ogawa, T., Muramoto, K.
  • 雑誌名: Biosci.Biotech.Biochem. 69(1) ページ: 255-257
  • NAID: 130000030587
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] In Vitro Evolutionary Thermostabilization of Congerin II : A Limited Reproduction of Natural Protein Evolution by Artificial Selection Pressure. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shionyu-Mitsuyama C et al.
  • 雑誌名: J Mol Biol. 347(2) ページ: 385-397
• [雑誌論文] Acid Hydrolysis of Protein in a Microcapillary Tube for the Recovery of Tryptophane. (2005)
  • 著者名/発表者名: Adebiyi, A.P., Jin, D.-H., Ogawa, _T., Muramoto, K.
  • 雑誌名: Biosci.Biotech.Biochem. 69(1) ページ: 255-257
  • NAID: 130000030587
• [雑誌論文] Complementary DNA Cloning and Molecular Evolution of Opine Dehydrogenases in Some Marine Invertebrates (2005)
  • 著者名/発表者名: Kimura, T., Nakano, T., Yamaguchi, T., Sato, M., Ozawa, _T., Muramoto, K.
  • 雑誌名: Marine Biotechnology 36(1)
  • NAID: 10014367484
• [雑誌論文] Complementary DNA Cloning and Molecular Evolution of Opine Dehydrogenases in Some Marine Invertebrates (2004)
  • 著者名/発表者名: Kimura, T., et al.
  • 雑誌名: Marine Biotechnology 6(5) ページ: 493-502
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The speciation of conger eel galectins by rapid adaptive evolution. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, T., et al.
  • 雑誌名: Glycoconjugate Journal 19 ページ: 451-458
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Refinement of Crystallization Condisions for the Crystal Growth Experiment of Animal Lectin (Congerin) in Space and the Evaluation of Grown Crystals. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamane, T., et al.
  • 雑誌名: J.Jpn.Soc.Microgravity Appl 21 ページ: 52-62
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Complementary DNA Cloning and Molecular Evolution of Opine Dehydrogenases in Some Marine Invertebrates (2004)
  • 著者名/発表者名: Kimura, T., Nakano, T., Yamaguchi, T., Sato, M., Ogawa, T., Muramoto, K., Yokoyama, T., Kan-no, N., Nagahisa, E., Janssen, F., Grieshaber, M.K.
  • 雑誌名: Marine Biotechnology 6(5) ページ: 493-502
  • NAID: 10014367484
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] The speciation of conger eel galectins by rapid adaptive evolution. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, T., Shirai, T., Shionyu-Mitsuyama, C., Yamane, T., Kamiya, H, Muramoto, K.
  • 雑誌名: Glycoconj.J. 19 ページ: 451-458
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Refinement of Crystallization Condisions for the Crystal Growth Experiment of Animal Lectin (Congerin) in Space and the Evaluation of Grown Crystals (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamane, T., Niwa, M., Miyabe, Y., Shionyu-Mitsuyama, C., Kondo, K., Suzuki, A., Ogawa, T., Muramoto, K., Nakamura, H., Sato, M., Yoshizaki, I., Yamanaka, A., Ataka, M.
  • 雑誌名: J.Jpn.Soc.Microgravity Appl. 21 ページ: 52-62
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] The speciation of conger eel galectins by rapid adaptive evolution. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, T., et al.
  • 雑誌名: Glycoconj.J. 19) ページ: 451-458
• [雑誌論文] Refinement of Crystallization Condisions for the Crystal Growth Experiment of Animal Lectin (Congerin) in Space and the Evaluation of Grown Crystals. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamane, T., et al.
  • 雑誌名: J.Jpn.Soc.Microgravity Appl. 21 ページ: 52-62
• [文献書誌] 白井剛, 塩生-光山クララ, 小川智久: "加速進化による蛋白質機能・構造の変化 魚類ガレクチンを例にして"蛋白質核酸酵素. 48. 1913-1919 (2003)
• [文献書誌] Chijiwa, T., Hamai, S., Tsumouchi, S., Ogawa, T., Deshimaru et al.: "Interisland mutation of a novel phospholipase A_2 from Trimeresurus flavovirisdis venom and evolution of crotalinae group II phospholipase A_2"Journal of Molecular Evolution. 57. 546-554 (2003)
• [文献書誌] Chijiwa, T., Yamaguchi, Y., Ogawa, T., Deshimaru et al.: "Interisland evolution of Trimeresurus flavovirisdis venom phospholipase A_2 isozyme"Journal of Molecular Evolution. 56. 286-293 (2003)
• [文献書誌] Ogawa, T., Yonemaru, S., Naganuma, T., Hirabayashi, J., Kasai, K., Muramoto, K.: "Strong Induction of Apoptosis of T Cell Lines by Conger Eel Galactins"Biomolecular Chemistry -A Bridge for the Future-. 134-137 (2003)
• [文献書誌] Ogawa, T., Shirai, T., Shionyu-Mitsuyama, C., Yamane, T., Kamiya, H., Muramoto, K.: "The speciation of conger eel galectins by rapid adaptive evolution"Glycoconjugate Journal. 19. 451-458 (2004)
• [文献書誌] Yoshimi, K., Shoji, M., Ogawa T., Yamauchi, A., Naganuma, T., Muramoto, K., Han: "Microstructure and Orientation Distribution of Aragonite Crystals in Nacreous Laver of Pearl Shells"Material Trans.. (In press).
• [文献書誌] Ohno, M., Ogawa, T., Oda-Ueda, N., Chijiwa, T., Hattori, S.: ""Accelerated evolution of snake venom gland isozyme", In Perspectives in Molecular Toxinology"John Wiley & Sons, Ed by A.Menez. 14 (2003)
• [文献書誌] Ogawa, T., Ishii, C., Suda, Y., Kamiya, H., Muramoto, K.: "High-level expression and characterization of fully active recombinant conger eel galectins in Eschericia coli"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66(2). 476-480 (2002)
• [文献書誌] Tateno, H., Ogawa.T., Muramoto, K., Kamiya, H., Saneyoshi, M.: "Rhamnose binding lectins from steelhead trout (Oncorhynchus mykiss) eggs recognize bacterial lipopolysaccharides and lipoteichoic acid"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66(3). 604-612 (2002)
• [文献書誌] Tateno, H., Ogawa.T., Muramoto, K., Kamiya, H., Saneyoshi, M.: "Distribution and molecular evolution of rhamnose-binding lectins in Salmonidae : isolation and characterization of two lectins from white-spotted Charr (Salvelinus leucomaenis) eggs"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66(6). 1356-1365 (2002)
• [文献書誌] Tateno, H., Shibata, Y., Nagahama, Y., Hirai, T., Saneyoshi, M., Ogawa.T., Muramoto, K., Kamiya, H.: "Tissue-specific expression of rhamnose-binding lectins in the steelhead trout (Oncorhynchus mykiss)"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66(6). 1427-1430 (2002)
• [文献書誌] Ogawa, T., Shirai, T., Yamane, T., Kamiya, H., Muramoto, K.: "Adaptive evolution of conger eel galectins"Trends in Glycosci. Glycotech.. 14(77). 177-187 (2002)
• [文献書誌] Shirai, T., Matsui, Y., Mitsuyama, C., Yamane, T., Kamiya, H., Ishii, C., Ogawa, T., Muramoto, K.: "Crystal structure of a conger eel galectin (congerin II) at 1.45 A resolution : Implication for the accelerated evolution of a new ligand-binding site following gene duplication"J. Mol. Biol.. 321. 879-889 (2002)