| 研究課題/領域番号 |
14360054
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
片岡 道彦 京都大学, 農学研究科, 助教授 (90252494)
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| 研究分担者 |
坂本 恵司 第一ファインケミカル(株), 研究部, 基盤技術開発担当部長(研究職)
小川 順 京都大学, 農学研究科, 助手 (70281102)
清水 昌 京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
15,000千円 (直接経費: 15,000千円)
2003年度: 4,200千円 (直接経費: 4,200千円)
2002年度: 10,800千円 (直接経費: 10,800千円)
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| キーワード | ラクトナーゼ / ラクトン / Fusarium oxysporum / Agrobacterium tumefaciens / 光学分割 / ラクトン環開裂酵素 / Acinetobacter calcoaceticus / 不斉加水分解 |
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| 研究概要 |
ラクトン化合物の代謝酵素のひとつと考えられるラクトン環開裂酵素(ラクトナーゼ)に関して、タンパク質化学的手法、遺伝子工学的手法等を用いて、その反応機構等に関する解析を行い、有用化合物の生産プロセスに応用可能な生体触媒としての機能開発を進めていった。
糸状菌Fusarium oxysporumの生産するラクトナーゼについて、Aspergillus oryzaeを用いた大量発現法により、高い活性を示す組換え菌株が得られた。本組換え菌株の菌体をアルギン酸カルシウムで固定化することにより、F.oxysporumの固定化菌体を用いた場合よりも効率的に、ラセミ体パントラクトンの光学分割を行うことが可能となった。さらに、N末端領域のシグナル配列に関しても、小胞体への輸送シグナル、糖鎖付加シグナルとしての役割があることを明らかにした。また、Agrobacterium tumefaciensの生産するラクトナーゼについても大腸菌を用いた大量発現に成功しており、これを触媒としたラセミ体パントラクトンの新たな光学分割法も開発した。
Acinetobacter calcoaceticusのラクトナーゼ(DCH)は、ハロペルオキシダーゼ活性をも有するユニークな多機能酵素である。DCH遺伝子を大量発現させた大腸菌菌体を触媒として、50%(w/v) DL-β-アセチルチオイソ酪酸メチルエステルあるいは25%(w/v)セトラキサートメチルエステルと作用させると、短時間で定量的に、かつ副生成物を伴わず選択的な加水分解反応により、D-β-アセチルチオイソ酪酸およびセトラキサートを生成させることに成功した。また、本酵素の遺伝子破壊を行った結果、DCH遺伝子破壊株では過酢酸への耐性が低下していることが明らかとなった。Northern解析等の結果とあわせて、DCHが過酸(過酢酸)の分解防除系に関与していることを推定した。
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