| 研究課題/領域番号 |
14360055
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山本 憲二 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (70109049)
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| 研究分担者 |
藤田 清貴 京都大学, 生命科学研究科, 学術振興会特別研究員
片山 高嶺 京都大学, 生命科学研究科, 助手 (70346104)
玉置 尚徳 京都大学, 生命科学研究科, 助手 (20212045)
羽田 勝二 (財)野口研究所, 研究員 (40270540)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
13,300千円 (直接経費: 13,300千円)
2003年度: 3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
2002年度: 9,400千円 (直接経費: 9,400千円)
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| キーワード | ムチン / Endo-β-N-acetylglucosaminidase / 糖転移活性 / Endo-α-N-acetylgalactosaminidase / ムチン型糖鎖 / ビフィズス菌 / Bifidobacterium longum / 機能性糖鎖複合体 / 糖タンパク質 / ケチン / エンドグリコシダーゼ / 糖鎖 |
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| 研究概要 |
本研究は、糖タンパク質の糖鎖をタンパク質との結合部より遊離する微生物のエンドグリコシダーゼの糖転移活性を活用して、生体防御機能を持つ人工ムチンを酵素合成し高度利用することを目的として行った。
N-グリコシド結合糖鎖をタンパク質との結合部のジアセチルキトビオース部分から切断するMucor hiemailisのEndo-β-N-acetylglucosaminidaseの糖転移活性を用いることにより、タンパク質やペプチドのAsn残基ではなく、Gln残基に糖鎖を結合することが可能かどうかを調べた。酵母Saccharomyces cerevisiaeが分泌する接合因子(α-mating factor)は酵母が栄養細胞になるために必要な生理活性ペプチドである。このGln残基に糖鎖を結合した糖ペプチドをFmoc法とエンドグリコシダーゼの糖転移活性を用いて化学-酵素合成した。得られた糖ペプチドは生理活性が低下していたが、ペプチダーゼに対する強い抵抗性を有していた。これらの結果より、グルタミン結合糖鎖を持つ糖ペプチドをエンドグリコシダーゼによって合成し得ることが示された。
Endo-α-N-acetylgalactosaminidaseはタンパク質のSer/Thr残基とα-O-グリコシド結合している糖鎖Galactosylβ1→3N-acetylgalactosamine二糖をタンパク質から遊離する酵素である。我々は代表的な腸内の善玉菌であるビフィズス菌の多くが本酵素を有することを見出した。そこで、Bifidobacterium longum JCM1217株について酵素反応を解析したところ、糖転移活性を有することを見出した。この糖転移活性を利用することにより、ビフィズス菌のみが資化または接着できる機能性糖鎖複合体(人工ムチン)を多量に酵素合成することを意図し、本酵素遺伝子のクローニングを試みた。先ず、既知の微生物酵素の分子量などの情報を基にして、全ゲノムが解読されているB.longum NCC2705株のゲノムデーターベースから本酵素の遺伝子を推測した。類推した遺伝子について、プライマーを設計し、B..longum JCM1217株のDNAを鋳型にしてPCRした結果、増幅したDNA断片を得た。これをベクターに繋いだ後、大腸菌DH5αに形質転換して大量発現させた。そこで、グルコースを受容体にし、p-NP-GalNAc-Galをムチン型糖鎖の供与体として糖転移反応を行ない、反応生成物をHPLCで単離した後、MSにて糖転移生成物を同定した。本糖転移活性が機能性糖鎖複合体の合成に有用であることが明らかになった。
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