オートフアジー性神経細胞死の制御機構に関する分子細胞生物学的研究

• 研究課題/領域番号: 14370005
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 解剖学一般(含組織学・発生学)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 内山 安男 阪大, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10049091)
• 研究分担者: 柴田 昌宏 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (10343253) ; 和栗 聡 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (30244908) ; 亀高 諭 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (10303950) ; 大澤 良之 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (30273642)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 14,000千円 (直接経費: 14,000千円); 2004年度: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2003年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円); 2002年度: 7,600千円 (直接経費: 7,600千円)
• キーワード: リソソーム / オートファジー / オートファゴソーム / カテプシンD / カテプシンB / TUNEL染色 / 海馬CA1錐体細胞 / 低酸素負荷 / オートファジ / ノックアウトマウス / インヒビター / 低酸素-脳虚血

研究概要

ノックアウトマウスを用いた検討:生後1週齢の野生型、カテプシンBおよびD欠損マウスを用いて低酸素負荷を行い海馬CA1錐体細胞の生存を調べた。その結果、カテプシンDを欠損したマウスのCA1錐体細胞は低酸素負荷しても、その80%は変化せず、虚血に耐性があることがわかった。カテプシンBを欠損するマウスのCA1錐体細胞は、障害を受けやすくなるが野生型マウスとの間で有意差はなかった。野生型マウスの死に方を検討した結果、低酸素負荷後3時間から6時間でカスパーゼ3の活性が上昇するが、24時間後には対照群と同様の値に復した。活性型のカスパーゼ3を認識する抗体で染色すると、一部の細胞のみ6時間、12時間、24時間後でTUNEL陽性細胞と一致したが、その多くはカスパーゼ3陰性であった。オートファゴソームの形成に必須なタンパク質としてLC3が知られているが、その抗体を作製し、負荷後3日までのオートファジー誘導の有無を検討した。その結果、死に行く細胞の細胞質にはLC3陽性のオートファゴソームが多数形成され、TUNEL陽性の細胞の多くは、オートファジーが誘導されていることがわかった。また、電顕的にもオートファゴソームを多数持つCA1錐体細胞が認められることがわかった。さらに、これらの細胞ではリソソームカテプシンDの免疫反応性が上昇することも明らかになった。すなわち、低酸素負荷によって、海馬CA1錐体細胞にオートファジが誘導され、その下流でリソソームカテプシンDが活性化される。これによって、何らかの細胞死につながる分子が活性化され、海馬CA1錐体細胞の死が誘導されるものと推測された。現在、この死に直接関与することが予想されるカテプシンDの基質を検索している。(結果を論文準備中)

研究成果

• [文献書誌] Nishimoto, S., Kawane, K., Watanabe-Fukunaga, R., Fukuyama, H., Ohsawa, Y., Uchiyama, Y., Hashida, N., Ohguro, N., Tano, Y., Morimoto, T., Fukuda, Y., Nagata, S.: "Nuclear cataract caused by a lack of DNA degradation in the mouse eye lens"Nature. 424. 1071-1074 (2003)
• [文献書誌] Wakasugi M., Wagun S., Kametaka S., Tomiyama, Y., Kanamori, S., Shiba, Y., Nakayama, K., Uchiyama, Y.: "Predominant expression of the short form of GGA3 in human cell lines and tissues"Biochem Biophys Res Commun. 306. 687-692 (2003)
• [文献書誌] Kametaka S, Shibata M, Moroe K, Kanamori S, Ohsawa Y, Waguri S, Sims PJ, Emoto K, Umeda M, Uchiyama Y.: "Identification of phospholipid scramblase 1 as a novel interacting molecule with β -secretase (β-site amyloid precursor protein (APP) processing enzyme (BACE))"J Biol Chem. 278. 15239-15245 (2003)
• [文献書誌] Koike, M., Shibata, M., Ohsawa, Y., Nakanishi, H., Koga, T., Kametaka, S., Waguri, S., Momoi, T., Kominami, E., Peters, C., Figura, K.von, Saftig, S., Uchiyama, Y.: "Involvement of two different cell death pathways in retinal atrophy of cathepsin D-deficient mice"Mol.Cell.Neurosci.. 14. 142-155 (2003)
• [文献書誌] Zhang, G., Ohsawa, Y., Kametaka, S., Shibata, M., Waguri, S., Uchiyama, Y.: "Regulation of FLRG expression in rat primary astroglial cells and injured brain tissue by transforming growth factor-b1 (TGF-b1)"J.Neurosci.Res.. 72. 33-45 (2003)
• [文献書誌] Waguri, S., Dewitte, F., Borgne, R., Rouille, Y., Uchiyama, Y., Dubremetz, J.F., Hoflack, B.: "Visualization of TGN to endosomes trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells"Mol.Biol.Cell. 14. 142-155 (2003)
• [文献書誌] Kametaka S, Shibata M, Moroe K, Kanamori S, Ohsawa Y, Waguri S, Sims PJ, Emoto K, Umeda M, Uchiyama Y: "Identification of phospholipid scramblase 1 as a novel interacting molecule with β-secretase(β-site amyloid precursor protein(APP)processing enzyme(BACE))"J Biol Chem.. (in press).
• [文献書誌] Koike, M., Shibata, M., Ohsawa, Y., Nakanishi, H., Koga, T., Kametaka, S., Waguri, S., Momoi, T., Kominami, E., Peters, C., Figura, K.von, Saftig, S., Uchiyama, Y.: "Involvement of two different cell death pathways in retinal atrophy of cathepsin D-deficient mice"Mol. Cell. Neurosci.. (in press).
• [文献書誌] Shibata, M., Koike, M., Waguri, S., Zhang, G., Koga, T., Uchiyama, Y.: "Cathepsin D is specifically inhibited by deoxyribonucleic acids"FEBS Letters. 517. 281-284 (2002)
• [文献書誌] Waguri, S., Dewitte, F., Borgne, R., Rouille, Y., Uchiyama, Y., Dubremetz, J.F., Hoflack, B.: "Visualization of TGN to endosomes trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells"Mol. Biol. Cell. 14. 142-155 (2003)
• [文献書誌] Suzuki, H., Yanaka, A., Shibahara, T., Matsui, H., Nakahara, A., Tanaka, N., Muto, H., Momoi, T., Y.Uchiyama: "Ammonia-induced apoptosis is accelerated at higher pH in gastric surface mucous cells"Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283. 986-995 (2002)
• [文献書誌] Kawane, K., Fukuyama, H., Yoshida, H., Nagase H., Ohsawa, Y., Uchiyama, Y., Nagaya, S.: "Impaired thymic development in mouse embryos deficient in apoptotic DNA degradation"Nature Immunology. 4. 138-144 (2003)