| 研究課題/領域番号 |
14370054
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
病態医化学
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
村上 清史 金沢大学, がん研究所, 教授 (90019878)
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| 研究分担者 |
林 直之 金沢大学, がん研究所, 助手 (50253456)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
11,900千円 (直接経費: 11,900千円)
2004年度: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
2003年度: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円)
2002年度: 5,000千円 (直接経費: 5,000千円)
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| キーワード | HCV / NS5B / NS5A / RNAレプリコン / ヌクレオリン / RNA依存RNA合成酵素(RdRP) / 集約型アラニン置換変異ライブラリー / HCV NS5B / アラニンスキャニング / 鋳型 / プライマー結合 / HCV複製 / オリゴマー |
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| 研究概要 |
HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。RNA依存RNA合成酵素(RdRP)であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。NS5Bに集約型(Cm)及び置換型(Pm)変異を導入しRdRP活性の検討を行い、RdRP活性に必須な5残基を新たに報告した。本研究では、RdRP活性と構造の研究を進め、NS5Bと相互作用するHCV NS5Aと宿主蛋白ヌクレオリンのRdRP活性への影響と、in vitroで得られた知見がHCV複製に与える影響を解析し、以下の成果を得た。
1)NS5Bがオリゴマー化することを見い出し、Cm変異解析によりオリゴマーに必須な2残基は、活性中心より離れたRdRP活性に必須な2残基と一致した。これはRdRP活性にオリゴマー化が必須であることを示した。2)NS5BとNS5Aの特異的結合を見い出し、NS5Bの4配列とNS5Aの2つの領域が相互作用に必要である。精製NS5Aは少量でRdRP活性を促進し、多量でRdRP活性を阻害した。3)我々は、ヌクレオリンとNS5B相互作用を見い出し、2蛋白の相互作用領域を限定した。この結合がNS5Bの細胞内局在に影響を与えた。4)MILE HCV RNAレプリコン系を用いて解析した結果、RdRP活性に必須な5アミノ酸残基がHCV複製に必須であった。5)HCV RNAレプリコン系にNS5AのNS5B結合領域にCm或はPmを導入した解析で、NS5B結合変異NS5AではHCV複製が起きず、NS5AとNS5Bとの相互作用がHCV複製に必須であることを強く示唆した。6)ヌクレオリンとNS5Bの相互作用の影響をHCV RNAレプリコン系で検討した。ヌクレオリン結合領域にCm或はPmを持つレプリコンは、HCV複製が起きないか極端に低下していた。SiRNA法でヌクレオリン発現が一時的に低下した細胞では、Hcv複製が1/3-1/4程度に低下した。
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