| 研究課題/領域番号 |
14370316
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
腎臓内科学
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
内田 信一 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (50262184)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
13,900千円 (直接経費: 13,900千円)
2003年度: 6,700千円 (直接経費: 6,700千円)
2002年度: 7,200千円 (直接経費: 7,200千円)
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| キーワード | CLCクロライドチャネル / ソーティング / ゴルジ体 / MDCK細胞 / バーター症候群 / 免疫沈降 / エンドソーム / ライソゾーム / neuronal ceroid lipofuscinosis / ノックアウトマウス / トランスジェニックマウス / F1F0-ATPase / Iysosomal storage disease / クロライドチャネル / 水チャネル |
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| 研究概要 |
1)CLC-3ノックアウトマウスの解析を行い報告した。CLC-3ノックアウトマウスはホモ変異体でも生存したが、明らかに成長が野生型に比して悪く、出生後の死亡率も高かった。さらに失調、神経細胞の脱落、網膜視細胞の脱落などの症状から、ヒトNeuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)モデルであるかを確認するため、電子顕微鏡的にライソゾーニム内に蓄積物質が存在するか否か、またNCLの、疎水性に富んだFlFO-ATPase subunitCが細胞内に蓄積することがいわれているので、その蓄積を免疫染色、細胞を分画後のウエスタンブロットにて検討した。この結果、細胞内にelectron denseなdepositを認め、subunitCの蓄積も確認されCLC-3ノックアウトマウスはヒトNCLモデルであることが確定した
2)次に、なぜCLC-3クロライドチャネルの異常がNCLに結びつくのかを探るため、CLC-3が存在する細胞内膜系の膜内のpHを測定した。In vivoではFITC-dextranをマウスの腹腔内に注射し、肝臓組織よりベジクルを生成し、蛍光により膜内のpHを測定した。この結果、ノックアウトマウスでは有意に高い膜内pHを認め、CLC-3が後期エンドソームないしライソゾームでpH環境維持に関与していることが示され、そのpH上昇が、ライソーゾーム酵素の活性を阻害し、いわゆるlysosomal storage diseaseを引き起こすのではないかと考えられた。
3)CLC-3,5とノックアウトマウスは作成されたが、同じファミリーに属するCLC-4のノックアウトマウスは報告がない。今回、ターゲティングベクターの作成を終了し、ES細胞の組み替え体を200クローンスクリーニングし、1ケ組み替え体をえた。キメラマウス作成中である。その他、膵ベータ細胞でのインスリン分泌にCLC-3の関与を報告する文献が存在したため、単離膵島細胞にてインスリン分泌能を検査したが、CLC-3ノックアウトで変化は見られなかった。
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