| 研究課題/領域番号 |
14370544
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 研究分野 |
耳鼻咽喉科学
|
|---|
| 研究機関 | 山口大学 |
|---|
研究代表者 |
山下 裕司 山口大学, 医学部, 教授 (00210419)
|
|---|
| 研究分担者 |
中井 彰 山口大学, 大学院・医学研究科, 教授 (60252516)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2002 – 2004
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
|
| 配分額 *注記 |
10,700千円 (直接経費: 10,700千円)
2004年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2003年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
2002年度: 5,700千円 (直接経費: 5,700千円)
|
|---|
| キーワード | 胚性幹細胞 / 内耳器官培養 / 分化 |
|---|
| 研究概要 |
マウスの胚性幹細胞に、green fluorescent protein (GFP)遺伝子をもつベクター(pcDNAneo3.1/GFP)をtransfectionさせ、蛍光下で緑色に発色する胚性幹細胞を作成した。
そして、この細胞を蝸牛器官培養と共培養させるにあたり、hanging drop法を用いて胚様体を分化させる手技を確立した。蝸牛器官培養は、生後6日のマウスの側頭骨を摘出し、蝸牛骨壁を除去、血管条、らせん靭帯、蝸牛軸などをはずし、コルチ器を取り出した。組織の摘出は、すべてクリーンベンチの中で、清潔操作で行った。コルチ器は、培養液(DMEM F12)に浸し、37度、5% CO_2の環境下で培養を行った。胚様体は、胚性幹細胞をleukemia inhibiting factor (LIF)の非存在下にin vitroで分化させて得られ、3胚葉いずれにも分化する能力を持つ。我々は、蛍光下で緑色に発色する胚性幹細胞を胚様体にまで分化させた。胚様体をnestinを用いて免疫染色をすると、胚体外胚葉に相当する部位にnestin陽性細胞を認めた。その胚様体を一度トリプシン処理して細胞を分離させた後、蝸牛器官培養の皿へ添加して共培養した。共培養を開始して3日目の蝸牛を4%パラホルムアルデヒドを用いて1時間、4度で固定した。そして、その生着部位について、surface preparation法、プラスチック包埋による薄切標本を用い検討を行った。移植した細胞は、コルチ器の外側、支持細胞層と思われる場所に生着していることが確認できた。しかし、有毛細胞の列には生着を確認できなかった。
|
