| 研究課題/領域番号 |
14370601
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
病態科学系歯学(含放射線系歯学)
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
中島 琢磨 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (90256678)
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| 研究分担者 |
土田 信夫 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60089951)
荒川 真一 東京医科歯科大学, 歯学部附属病院, 助手 (20302888)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
14,000千円 (直接経費: 14,000千円)
2003年度: 5,900千円 (直接経費: 5,900千円)
2002年度: 8,100千円 (直接経費: 8,100千円)
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| キーワード | Tannerella forsyhensis / Actinobacillus actinomycetemcomitans / cytocidal toxin / Cytolethal distending toxin / 殺細胞因子 / 細胞障害 / Bacterial pathogen / モノクローナル抗体 / Tannerella forsythensis / cellular toxicity / Cytolethal distending toxin(Cdt) / Cytocidal toxin / p53 / monoclonal antibody / ELISA / 歯周病 / 病原因子 / 遺伝子 / ORF / 組換え蛋白質 / 精製 |
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| 研究概要 |
[I] Tannerella forsythensisの抽出液より分離精製したCytolethal distending toxin (CDT)様活性を有する殺細胞因子(T.forsytus cytocidal toxin ; Tf-CCT)の遺伝子を単離・同定し、その組換えタンパクを調製して細胞障害活性を確認した。BLASTpによるアミノ酸配列比較から、Tf-CCrの細胞障害機構の一部を推定した。以下に具体的な成果の概要を列記する。
(a)陰イオン交換、ゲル濾過、Heparin親和性により高度に精製したTf-CCT活性画分に含まれ、殺細胞活性を減弱できるモノクローナル抗体Be-24と反応する28.5kDaタンパクのN-末端アミノ酸配列APQNMDVLLを得た。T.forsythusゲノムDNAライブラリーからPCR法とクローニングによって得たそれぞれの遺伝子断片の塩基配列から、Tf-CCTがprtHプロテアーゼ(prtH)であることが分かった。精製Tf-CCTの分子量から、翻訳開始コドンはprtHより上流と推定した。
(b)prtHと同じORFに属する最上流のATG(ribosome binding motif ; RBS無し)、5番目佃(RBS有り、prtHの開始コドンとされる)、8番目(RBS有り)をそれぞれ開始コドンとする遺伝子断片を数種の発現ベクターに挿入しすべて大腸菌で発現しなかった。in vitro発現システム(RTS ; Roche社、PURESYSTEM ;ポストゲノム研究所)では調製可能だった
(c)ヒト口腔上皮癌細胞株KBに組換えTf-CCT投与し、5番の開始コドンから翻訳されたものが最も強い細胞傷害活性を示すことが分かった。
(d)ヒトCCTはCDT様因子と構造的類似性が無い。BLASTp解析でC-末端側にヒトの小胞体とゴルジ体間の膜融合制御に関与するSlylpのドメイン3と相同な領域を見出した。このことから、Tf-CCTは細胞内膜融合制御関連因子群と相互作用し、細胞障害を起こすことが推定された。
(e)大腸菌での組換えTf-CCT調製を目的としてTag付加を検討し、C-末端側のStrep-tag付加で調製可能となった。
(f)歯周病患者歯肉溝浸出液中の抗Tf-CCT抗体検出のためELISA法を検討した。100ngの粗精製抗原を用い、20ngの抗体を検出した。
[II] Actinobacillus actinomycetemcomitans serotype (a)の抽出液の殺細胞活性は典型的なCdt様活性であった。そこで同細菌のゲノムDNAライブラリーからcdtB遺伝子(Aaa-cdtB)を分離した。塩基配列上でserotype(b)のcdtB遺伝子と2箇所異なるが、アミノ酸配列は同一であった。歯周病患者歯肉溝浸出液中の抗Aaa-CdtB抗体検出のためELISA法を検討した。
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