| 研究課題/領域番号 |
14370755
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医薬分子機能学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
杉浦 幸雄 京都大学, 化学研究所, 教授 (40025698)
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| 研究分担者 |
永岡 真 京都大学, 化学研究所, 助手 (60314275)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
14,800千円 (直接経費: 14,800千円)
2004年度: 4,300千円 (直接経費: 4,300千円)
2003年度: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2002年度: 6,900千円 (直接経費: 6,900千円)
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| キーワード | 亜鉛フィンガー / マルチフィンガー / 分子設計 / 転写因子 / DNA認識 / アーキテクチャー / 塩基特異性 / 人工タンパク質 / 遺伝子発現 / タンパク質工学 / タンパク質設計 |
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| 研究概要 |
3〜15個の亜鉛フィンガーモチーフを持つ天然および人工マルチ亜鉛フィンガー蛋白質を単離又は創製し、DNA/RNA認識におけるマルチ亜鉛フィンガーの順列や数の変化を追究した。即ち、亜鉛フィンガー蛋白質の核酸結合は、そのレパートリーの中から順列や数を変えて用いることによって遺伝子発現を調節し、このことによって1つのマルチ亜鉛フィンガー蛋白質が幾つもの転写蛋白質を用いるのと同じ役割を演じて、それぞれ腹個の転写因子を用意する手間を節約していることが暗示された。また、個々の亜鉛フィンガーは柔軟な連結部でつながれ、それぞれ独立した"読み取りヘッド"として機能しているように推定されているが、マルチ亜鉛フィンガーの存在は、DNA認識における相補性・共同性によって、核酸結合の親和性や選択性の上昇に大きく寄与している可能性が指摘された。転写因子Sp1由来の3つの亜鉛フィンガーを1ユニットとして、ユニット同志を遺伝子工学的手法を用いて連結させることにより、15個の亜鉛フィンガーを有する新規タンパク質を精製・単離した。ユニット間のリンカー部分には多くの亜鉛フィンガーのリンカー領域に保存されているアミノ酸配列(TGEKP)を採用したが、リンカー配列の影響を検討するため転写因子TFIIIAタイプのリンカーを有する15-亜鉛フィンガータンパク質も創製した。これら新規マルチ亜鉛フィンガータンパク質のDNA結合性を詳細に調べるためGC配列に富んだDNAを新たに調整し、ゲルシフト法・フットプリント法などを駆使した。その結果、45塩基対にも及ぶ5個の連続したGCボックスに特異的に結合できることが判明した。また、GCボックス内にATミスマッチを導入したDNAに対する結合性についても検討した。本研究によって遺伝子調節におけるマルチ亜鉛フィンガーの重要な役割が明らかにされた。
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