新生分泌系蛋白の高次構造再編及び輸送シグナル認識に関する研究

• 研究課題/領域番号: 14380295
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 福島県立医科大学 (2003); 札幌医科大学 (2002)
• 研究代表者: 和田 郁夫 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (40182969)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 15,000千円 (直接経費: 15,000千円); 2003年度: 7,200千円 (直接経費: 7,200千円); 2002年度: 7,800千円 (直接経費: 7,800千円)
• キーワード: 小胞体 / 分子シャペロン / カルネキシン / 品質管理 / 糖タンパク質 / 蛍光相関分光法 / フォールディング / フィブリノーゲン / 分泌過程 / EDEM

研究概要

小胞体内におけるタンパク質の立体構築の形成と管理の機構を解明するために、生化学的な手法を用いた研究と、イメージングを用いる光学的手法の双方からのアプローチを行った。前者の成果として、先に異常分子の分解を糖鎖認識を介して促進する因子として同定したEPEMの作用機序の解明の過程で、この蛋白がcalnexinと安定複合体を形成することを見いだし、更に基質である糖タンパクのプロセッシングに伴って引き渡しを行うことを示した。また、ジスルフィド結合の再編の機構を明らかにするために、複雑な4次構造を形成し数多くのジスルフィド結合を持つ分泌蛋白fibrinogenを新たにモデル分子として用いて、解析を行い、特に、小胞体から排除できない異常な構造を作った場合の処理機構について明らかにした。また、顕微鏡を用いたアプローチとして、1分子レベルでの分子の挙動の解析が可能となる性質を利用した蛍光相関分光法(FCS)を応用する試みを行った。その結果、これまで記述されたことのないランダムな拡散の強い抑制が、分子のfoldabilityに関連することを明らかにした。また。生きた細胞内での2分子間の相互作用をリアルタイムでモニターするために、このFCSと関連した蛍光共相関分光法を用いて、mRFPとGFPとで生細胞で解析が可能なことを示した。ただし、mRFPの蛍光強度の不足のため、より明るくflickeringの少ないものが必要とされることが示された。更に、単一分子レベルでの小胞体内の解析を進めることにより、現在、小胞体ネットワーク内での糖タンパク質の1個の分子の動きを可視化することに成功し、小胞体内腔においてN型糖鎖を持つものには特有のダイナミクス制御機構が備わっていることを見いだしている。なおプロ体を認識する蛋白の同定については、得られた候補蛋白の機能について明確な証拠が得られず、さらなる検討が必要となった。

研究成果

• [雑誌論文] Δ508 CFTR pool in the endoplasmic reticulum is increased by calnexin overexpression. (2004)
  • 著者名/発表者名: Okiyoneda T et al.
  • 雑誌名: Mol.Biol.Cell 15・2 ページ: 563-574
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Regulation of immature protein dynamics in the endoplasmic reticulum. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kamada et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279・20 ページ: 21533-21542
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Direct detection of caspase-3 activation in single live cells by cross-correlation analysis (2004)
  • 著者名/発表者名: Saito K et al.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 324・2 ページ: 849-854
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 小胞体内での蛋白質の動態 (2004)
  • 著者名/発表者名: 和田郁夫 et al.
  • 雑誌名: 蛋白質核酸酵素 49・7 ページ: 1018-1022
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Enhancement of Endoplasmic Reticulum (ER) Degradation of Misfolded Null HongKong al-Antitrypsin by Human ER Mannosidase I. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hosokawa, N., Tremblay, L.O., You, Z., Herscovics, A., Wada, I., Nagata, K.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278-28 ページ: 26287-26294
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Differential localization of lipid phosphate phosphatases 1 and 3 to cell surface subdomains in polarized MDCK cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Jia, Y-J., Kai, M., Wada, I., Sakane, F., Kanoh, H.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 552-(2-3) ページ: 240-246
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Delta F508 CFTR pool in the endoplasmic reticulum is increased by calnexin overexpression. (2004)
  • 著者名/発表者名: Okiyoneda T, Wada I, Jono H, Shuto T, Yoshitake K, Nakano N, Nagayama S, Harada, K, Isohama Y, Miyata T, Kai H.
  • 雑誌名: Mol.Biol.Cell 15-2 ページ: 563-574
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Regulation of immature protein dynamics in the endoplasmic reticulum. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kamada, A., Nagaya, H., Tamura, T., Kinjo, M., Jin, H.-Y., Yamashita T., Jimbow, K., Kanoh, H, Wada, I.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279-20 ページ: 21533-21542
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Direct detection of caspase-3 activation in single live cells by cross-correlation analysis. (2004)
  • 著者名/発表者名: Saito K, Wada I, Tamura M, Kinjo M.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 324-2 ページ: 849-854
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Dynamics of proteins in the endoplasmic reticulum. (2004)
  • 著者名/発表者名: Wada I.
  • 雑誌名: Tanpakushitukakusannkouso 49-7 ページ: 1018-1022
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] CrkL Directs ASAP 1 to Peripheral Focal Adhesions. (2003)
  • 著者名/発表者名: Oda, A.et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278・8 ページ: 6456-6460
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] EDEM as an Acceptor of Terminally Misfolded Glycoproteins Released from Calnexin. (2003)
  • 著者名/発表者名: Oda, Y.et al.
  • 雑誌名: Science 299・5611 ページ: 1394-1397
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Enhancement of Endoplasmic Reticulum (ER) Degradation of Misfolded Null Hong Kong al-Antitrypsin by Human ER Mannosidase I (2003)
  • 著者名/発表者名: Hosokawa et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278・28 ページ: 26287-26294
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Differential localization of lipid phosphate phosphatases 1 and 3 to cell surface subdomains in polarized MDCK cells. (2003)
  • 著者名/発表者名: Yan-Jun ha, et al.
  • 雑誌名: FEBS Letters 552 ページ: 240-246
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Cyclic AMP induces phosphorylation of claudin-5 immunoprecipitates and expression of claublood-brain-barrier endothelial cells via protein kinase A-dependent and -independent pathwa (2003)
  • 著者名/発表者名: Ishizaki T et al.
  • 雑誌名: Exp Cell Res. 290・2 ページ: 275-288
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Accumulation of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone regulator BAG-1 on COPI-coated structures in gastric epithelial cells. (2003)
  • 著者名/発表者名: Takamura A et al.
  • 雑誌名: Int J Oncol. 23・5 ページ: 1301-1308
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] EDEM as an Acceptor of Terminally Misfolded Glycoproteins Released from Calnexin. (2003)
  • 著者名/発表者名: Oda, Y., Hosokawa, N., Wada, I., Nagata, K.
  • 雑誌名: Science. 299-5611 ページ: 1394-1397
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Cyclic AMP induces phosphorylation of claudin-5 immunoprecipitates and expression of claudin-5 gene in blood-brain-barrier endothelial cells via protein kinase A-dependent and -independent pathways. (2003)
  • 著者名/発表者名: Ishizaki T, Chiba H, Kojima T, Fujibe M, Soma T, Miyajima H, Nagasawa K, Wada I, Sawada N.
  • 雑誌名: Exp.Cell Res. 290-2 ページ: 275-288
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Accumulation of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone regulator BAG-1 on COPI-coated structures in gastric epithelial cells. (2003)
  • 著者名/発表者名: Takamura A, Adachi M, Wada I, Mitaka T, Takayama S, Imai K.
  • 雑誌名: Int.J.Oncol. 23-5 ページ: 1301-1308
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Tyrosinase and tyrosinase-related protein 1 require rab7 for their intracellular transport (2002)
  • 著者名/発表者名: Hirosaki, K.et al.
  • 雑誌名: J.Inv.Dermatol. 119・2 ページ: 475-480
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Calnexin partially reverses the misprocessing of the Delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (2002)
  • 著者名/発表者名: Okiyoneda T.et al.
  • 雑誌名: FEBS Lett 526・(1-3) ページ: 87-92
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Tyrosinase and tyrosinase-related protein 1 require rab7 for their intracellular transport. (2002)
  • 著者名/発表者名: Hirosaki, K., Yamashita, T., Wada, I., Jin, H-Y, Jimbow K.
  • 雑誌名: J.Inv.Dermatol. 119-2 ページ: 475-480
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Calnexin Delta 185-520 partially reverses the misprocessing of the Delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. (2002)
  • 著者名/発表者名: Okiyoneda T, Wada I, Jono H, Shuto T, Yoshitake K, Nakano N, Nagayama S, Harada, K, Isohama Y, Miyata T, Kai H.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 526-(1-3) ページ: 87-92
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] CrkL Directs ASAP1 to Peripheral Focal Adhesions.
  • 著者名/発表者名: Oda, A., Wada, I., Miura, K., Okawa, K., Kadoya, T., Kato, T., Nishihara, H., Maeda, M., Tanaka, S., Nagashima, K., Nishitani, C., Matsuno, K., Ishino, M., Machesky, L., Fujita, H., Randazzo, P.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278-8 ページ: 6456-6460
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kamada et al.: "Regulation of immature protein dynamics in the endoplasmic reticulum"Journal of Biological Chemistry. (in press).
• [文献書誌] Okiyoneda et al.: "F508 CFTR pool in the endoplasmic reticulum is increased by calnexin overexpression"Molecular Biology of the cell. 15・2. 563-574 (2004)
• [文献書誌] Takamura et al.: "Accumulation of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone regulator BAG-1 on COPI-coated structures in gastric epithelial cells."International Journal of Onocology. 23・5. 1301-1308 (2003)
• [文献書誌] Ishizaki et al.: "Cyclic AMP induces phosphorylation of claudin-5 immunoprecipitates and expression of claudin-5 gene in blood-brain-barrier endothelial cells via protein kinase A-dependent and -independent pathways"Experimental Cell Research. 290・2. 275-288 (2003)
• [文献書誌] Jia et al.: "Differential localization of lipid phosphate phosphatases 1 and 3 to cell surface subdomains in polarized MDCK cells"FEBS letter. 552・2-3. 240-246 (2003)
• [文献書誌] Hosakawa et al.: "Enhancement of Endoplasmic Reticulum (ER) Degradation of Misfolded Null Hong Kong {alpha}1-Antitrypsin by Human ER Mannosidase I"Journal of Biological Chemistry. 278・28. 26287-26294 (2003)
• [文献書誌] Oda Y, Hosokawa N, Wada I, Nagata K: "EDEM as an Acceptor of Terminally Misfolded Glycoproteins Released from Calnexin"Science. 299. 1394-1397 (2003)
• [文献書誌] Oda A, Wada I et al.: "CrkL Directs ASAPl to Peripheral Focal Adhesions"J. Biol. Chem.. 278・8. 6456-6460 (2003)
• [文献書誌] Okiyoneda T, Wada I et al.: "Calnexin Delta 185-520 partially reverses the misprocessing of the Delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator"FEBS Lett. 526・1-3. 87-92 (2002)
• [文献書誌] Hirosaki K, Yamashita T et al.: "Tyrosinase and tyrosinase-related protein 1 require rab7 for their intraceilular transport"J. Inv. Dermatol.. 119. 475-480 (2002)
• [文献書誌] Taniguchi T., Kuroda R et al.: "A critical role for the carboxy terminal region of the proprotein convertase, PACE4A, in the regulation of its autocatalytic activation coupled with secretion"Biochem. Biophys. Res. Com.. 290・2. 878-884 (2002)