4次元結晶構造解析法によるニトリルヒドラターゼの水和反応その場観察

• 研究課題/領域番号: 14380321
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生物物理学
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 神谷 信夫 独立行政法人理化学研究所, 研究技術開発室・室長(副主任待遇) (60152865)
• 研究分担者: 河野 能顕 独立行政法人理化学研究所, 研究技術開発室, 研究員 (70321750) ; 古瀬 宗則 独立行政法人理化学研究所, 研究技術開発室, 協力研究員 (50321807) ; 野尻 正樹 独立行政法人理化学研究所, 研究技術開発室, 基礎科学特別研究員 (20333346) ; 尾高 雅文 独立行政法人理化学研究所, バイオ工学研究室, 助教授 (20224248) ; 小林 達彦 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (70221976) ; 遠藤 勲 宇都宮大学, 農学部, 教授 (00087470)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 13,300千円 (直接経費: 13,300千円); 2003年度: 3,800千円 (直接経費: 3,800千円); 2002年度: 9,500千円 (直接経費: 9,500千円)
• キーワード: ニトリルヒドラターゼ / 光活性化過程 / 4次元結晶構造解析 / SPring-8 / 大角度回転結晶法 / 部位特異的変異体 / SPning-8 / 小型カッパーゴニオメータ / イソニトリルヒドラターゼ

研究概要

ニトリルに水を付加するニトリルヒドラターゼ(NHase)を材料とし,SPring-8のBL45XUにおいて,大角度回転結晶法(LOT)による4次元結晶構造解析を可能とした.これにより10分オーダーの時間分解能を達成することができた.
NHaseの光活性化過程を単一の結晶を用いてLOTにより追跡した.光により鉄から一酸化窒素が解離するとともに新たな水分子が鉄に配位する過程,鉄の配位子場を構成しているシステインスルフェン酸(αCys114-SOH)の酸素原子の極近傍(2.5Å)に新たな水分子が出現する過程を見いだした.これらの水分子はNHaseの水付加反応機構に直接関与するものと予想された.不活性型NHaseの反応キャビティに基質および基質類似体を導入し,それぞれ光活性化後の反応過程を追跡した.
NHaseの反応キャビティにはαGln90が存在し,反応中心を取り巻く水分子と水素結合している.αGln90をGluまたはAsnに置換した突然変異体を作製して酵素活性を検定したところ,αGln90Gluは野生型の1/4程度に,αGln92Asnでは1/50以下に低下していた.これらの結果からαGln90の側鎖は,NHaseの水付加活性に直接関与していることが示唆された.
NHaseと機能の類似したイソニトリルヒドラターゼ(INH)の遺伝子を同定し,大腸菌での高発現系構築に成功した.部位特異的変異法によりINHの活性アミノ酸残基の同定を試み,Cys101が触媒機構上必須であり,またThr102も重要な役割を果たすことを明らかにした.

研究成果

• [雑誌論文] Protonation Structures of Cys-Sulfinic Acids in the Photosensitive Nitrile Hydratase Revealed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (2003)
  • 著者名/発表者名: Noguchi, T., Nojiri, M., Takaei, K., Odaka, M., Kamiya, N.
  • 雑誌名: Biochemistry 42 ページ: 11642-11650
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Crystal structure of Thermus themophilus HB8 H-protein of the glycine cleavage system, resolved by a six-dimensional molecular-replacement method (2003)
  • 著者名/発表者名: Nakai, T., Ishijima, J., Masui, R., Kuramitsu, S., Kamiya, N.
  • 雑誌名: Acta Cryst.Sec.D 59 ページ: 1610-1618
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Crystal structure of fucose specific lectin from Aleuria aurantia binding ligands at three of its five sugar recognition sites (2003)
  • 著者名/発表者名: Fujihashi, M., Peapus, D.H., Kamiya, N., Nagata, Y., Miki, K.
  • 雑誌名: Biochemistry 42 ページ: 11093-11650
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A novel inhibitor for Fe-type nitrile hydratase:2-cyano-2-propylhydroperoxide (2003)
  • 著者名/発表者名: Tsujimura M., Odaka M., Nakayama H., et al.
  • 雑誌名: J.Am.Chem.Soc. 125 ページ: 11532-11538
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas cholororaphis B23:Sequencing, gene expression, purification and characterization (2003)
  • 著者名/発表者名: Oinuma, K-I., Hashimoto, Y., Konishi, K., Goda, M., Noguchi, T., Higashibata, H., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278 ページ: 29600-29608
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Protonation Structures of Cys-Sulfinic Acids in the Photosensitive Nitrile Hydratase Revealed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (2003)
  • 著者名/発表者名: Noguchi, T., Nojiri, M., Takei, K., Odaka, M., Kamiya, N.
  • 雑誌名: Biochemistry 42 ページ: 11642-11650
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Crystal structure of Thermus thermophilus HB8 H-protein of the glycine cleavage system, resolved by a six-dimensional molecular-replacement method (2003)
  • 著者名/発表者名: Nakai, T., Ishijima, J., Masui, R., Kuramitsu, S., Kamiya, N.
  • 雑誌名: Acta Cryst. Sec. D 50 ページ: 1610-1618
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Crystal structure of fucose specific lectin from Aleuria aurantia binding ligands at three of its five sugar recognition sites (2003)
  • 著者名/発表者名: Fujihashi, M., Peapus, D.H., Kamiya, N., Negate, Y., Miki, K.
  • 雑誌名: Biochemistry 42 ページ: 11093-1150
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A novel inhibitor for Fe-type nitrile hydratase:2-cyano-2-propyl hydroperoxide (2003)
  • 著者名/発表者名: Tsujimura M., Odaka M., Nakayama H., et al.
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc. 125 ページ: 11532-11538
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas chlororaphis B23: Sequencing, gene expression, purification and characterization (2003)
  • 著者名/発表者名: Oinuma, K-I., Hashimoto, Y., Konishi, K., Goda, M., Noguchi, T., Higashibata, H., Kobayashi, M.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 278 ページ: 29600-29608
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Isonitrile hydratase from Pseudomonas putida N19-2:Cloning, sequencing, gene expression, and identification of its active amino acid residue (2002)
  • 著者名/発表者名: Goda, M., Hashimoto, Y., Shimizu, S., et al.
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 276 ページ: 45860-45865
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Isonitrile hydratase from Pseudomonas putida N19-2: Cloning, sequencing, gene expression, and identification of its active amino acid residue (2002)
  • 著者名/発表者名: Goda, M., Hashimoto, Y., Shimizu, S.et al.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 276 ページ: 45860-45865
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nakai, T., Ishijima, J., Masui, R., Kuramitsu, S., Kamiya, N.: "Crystal structure of Thermus thermophilus HB8 H-protein of the glycine cleavage system, resolved by a six-dimensional molecular replacement method"Acta Cryst.Sec.D. 59. 1610-1618 (2003)
• [文献書誌] Fujihashi, M., Peapus, D.H., Kamiya, N., Nagata, Y., Miki, K.: "Crystal structure of fucose specific lectin from Aleuria aurantia binding ligands at three of its five sugar recognition sites"Biochemistry. 42. 11093-11650 (2003)
• [文献書誌] Noguchi, T., Nojin, M., Takei., K., Odaka, M., Kamiya, N.: "Protonation Structures of Cys-Sulfinic Acids in the Photosensitive Nitrile Hydratase Revealed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy"Biochemistry. 42. 11642-11650 (2003)
• [文献書誌] Tsujimura, M., Okada M., Nakayama H., et al.: "A novel inhibitor for Fe-type nitrile hydratase : 2-cyano-2-propyl hydroperoxide"J.Am.Chem.Soc.. 125. 11532-11538 (2003)
• [文献書誌] Oinuma, K-I., Hashimoto, Y., Konishi, K., Goda, M., Noguchi, T., Higashibata, H., Kobayashi, M.: "Novel aldoxime dehydratase involved in carbon-nitrogen triple bond synthesis of Pseudomonas chlororaphis B23 : Sequencing, gene expression, purification and characterization"J.Bio.Chem.. 278. 29600-29608 (2003)
• [文献書誌] 合田昌彦, 東端啓貴, 橋本義輝, 小林達彦: "新規酵素イソニトリルヒドラターゼの発見"バイオサイエンスとインダストリー. 61. 469-472 (2003)
• [文献書誌] Kamiya, N., Shen, J-R: "Crystal Stiucture of oxygene-volving photosystem II from Thermosynechococcus vulcanus at 3.7 A resolution"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(1). 98-103 (2003)
• [文献書誌] Fujihashi, M., Peapus, D.H., Nakajima, F., et al.: "X-ray crystallographic characterization and phasing of a fucose specific lectin from Aleuria aurantia"Acta Cryst. sec D. 59(In press). (2003)
• [文献書誌] Nakai, T., Nakagawa, N., Maoka, N., et al.: "Coexpression, purification, crystallization and preliminary X-ray characterization of glycin decarbosylase (P-protein), a constituent of the glycin cleavage system from Thermus thermophilus HP8"Acta Cryst. sec D. 59(In press). (2003)
• [文献書誌] Goda, M., Hashimoto, Y., Shimizu, S., et al.: "Isonitrile hydratase from Pseudomonas putida N19-2: Cloning, sequencing, gene expression, and identification of its active amino acid residue"The Journal of Biological Chemistry. 276・(26). 45860-45865 (2002)