| 研究概要 |
I.単細胞緑藻カサノリのV-ATPaseサブユニットアイソフォームの酵母での発現及び機能解析
液胞型のプロトンポンプであるV-ATPaseのproteolipid subunit(プロトン輸送路を形成)のアイソフォームが、カサノリの場合6種類存在する(Vc1〜Vc6)。酵母機能相補試験により、以下の結果を得た。
1)Vc1〜6は、一次構造から二つのグループに分けられる(Vc1 & 3及びVc2,4,5,6)。Vc2,4,5,6は、酵母V-ATPaseのVma3pとして機能することを明らかにした。更に、Vc1,3も、強制大量発現を行えば、機能相補性を示すことをみいだした。
2)Vc1〜6は、酵母proteolipid subunit c'をコードするVMA11欠損株を機能相補できないことを明らかにした。すなわち、Vma11pとして機能できないことをみいだした。
II.単細胞緑藻カサノリのV-ATPaseサブユニットアイソフォームのカサノリ細胞での発現
6種類のproteolipid subunit isformsのカサノリ細胞における発現について、特異的なペプチド抗体を用い、ウェスタン解析及び免疫組織染色により検討した。
1)カサ形成後のreproductive phaseの細胞では、Vc1,Vc2,Vo4 isoformsのポリペプチドがカサ部に、Vc2,Vc4 isoformsが茎部に、Vc2 isoformが極微量、毛部(whorl of hairs)に検出された。もう一つのプロトンポンプであるV-PPaseは、カサ、茎、毛部にほぼ同量検出された。このことは、毛部液胞膜の主要なプロトンポンプは、V-PPaseであることを示唆する結果である。
2)reproductive phaseの細胞のカサ部に焦点をあて、固定後作製した切片の免疫組織染色を行った。その結果、カサ部の液胞膜にVc1,Vc2及びVc4抗体と反応する二次抗体Alexa Fluor 488に由来する蛍光ドットが観察された。このことは、上記1)のウェスタン解析の結果と一致する。
3)カサノリから調製したtotal RNAを用いたノーザン解析の結果、Vc1〜6すべてのmRNAが明瞭に検出された。これらの結果をまとめると、Vc3,Vc5,Vc6 isoformsの場合、ペプチド抗体作製に用いたN末端近傍のアミノ酸配列がプロセシングを受けている可能性が高い。
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