| 研究概要 |
任意の細胞密度の人工組織,単層培養細胞,懸濁細胞を準備し,冷却速度をパラメータとして凍結・解凍し生存率を調べた.そして,染色人工組織と,単層培養細胞の位相差光学顕微鏡観察により未凍結状態の細胞の構造を明らかにした.ヒト皮膚繊維芽細胞を,コラーゲンスポンジ(高研CS-100,φ20×1mm)中で密度10^5〜10^7cells/cm^3で培養した人工組織,φ35mm培養皿上で面積密度約10^4〜約10^6cells/cm^2で培養した単層細胞,密度10^5〜10^7cells/cm^3で縣濁した細胞を実験に用いた.凍結保護物質には,10%ジメチルスルホキシドを用いた.冷却源に液体窒素を用い,ヒーターに加える電圧を調節計(横河電機UP750)で制御することで,試料を冷却速度0.1〜約100℃/minで10から-180℃以下まで冷却した.その後解凍し,トリパンブルー色素排除試験法により細胞生存率を測定した.そして未凍結の,ヘマトキシリン・エオシン染色した人工組織切片,そして,単層培養細胞の位相差顕微鏡観察も行った.また,解凍後の懸濁細胞に蛍光物質(Molecular Probes SYTO^<【○!R】> 13)を加え,倒立蛍光顕微鏡(ニコンTE300-DEF-S)を用いて生存率測定を行った.その結果,人工組織と単層培養において,細胞密度が高くなると,最適冷却速度が低冷却速度側にシフトし,生存率が低下した.そして,高密度の人工組織と単層培養では,細胞同士の接触が観察された.しかし,縣濁細胞においては細胞密度増加に伴う顕著な生存率低下はなかった.観察された形態は,単層培養細胞では紡錘状で縣濁細胞では球状であり,縣濁細胞の方が小さかった.よって,縣濁細胞は球形で小さいため同じ細胞密度でも接触しにくいため生存率が低下しなかったと考えられた.また,蛍光物質とトリパンブルーを用いた場合の生存率の間に相関が見られた.
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