| 研究課題/領域番号 |
14550769
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
春木 満 日本大学, 工学部, 助教授 (30273593)
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| 研究分担者 |
森川 正章 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (20230104)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
2003年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2002年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 組換えDNA実験 / 低温菌 / 熱失活性酵素 / 低温活性酵素 / アルカリフォスファターゼ / DNAリガーゼ / Bg1II / RNase A / BglII / グリーン化 |
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| 研究概要 |
当該研究は、フェノール処理などの操作を不要とすることにより、組換えDNA実験のグリーン化を進めることを目指し、熱失活性のApase、RNase A、制限酵素の開発を目的とする。また、通常低温で行われる連結反応の効率化を目指し、低温において高い活性を有するDNAリガーゼの開発を目的とする。
SIB1株由来のAPaseの諸特性を解析したところ、至適反応温度は約40℃であり、大腸菌由来酵素と比較して約20℃低温側にシフトしていた。また安定性も大腸菌由来酵素が80℃で1時間処理しても60%の活性を保持するのに対して本酵素は80℃で5分処理するだけで速やかに失活した。本酵素は40℃での酵素反応において大腸菌由来酵素と比べて5倍以上高い触媒効率を示し、20℃でも十分な活性を維持していることがわかった。
低温菌DNAリガーゼについては、近縁でゲノム配列の解読されているS.oneidensisのDNAリガーゼの遺伝子の配列をもとにPCRプライマーを合成し、SIB1株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った結果、600bpの断片が増幅された。この断片の塩基配列を決定したところ、そのコードするアミノ酸配列は、S.oneidensisのDNAリガーゼと77%の同一性を示し、SIB株のDNAリガーゼ遺伝子の一部であることがあきらかとなった。
RNase Aおよび制限酵素Bg1IIの熱失活性変異体を取得するために、これらの酵素遺伝子に6×Hisタグ配列を付加し、M13ファージのpIIIコート蛋白質遺伝子のN末端に挿入した。構築した遺伝子をもつ大腸菌にヘルパーファージを感染させ、ファージ粒子を調製し、抗M13抗体を用いたELISA法により、Ni-NTAプレートへの結合を調べたが、プレートへの特異的結合はみられなかった。したがって、酵素がファージ上へうまくディスプレイされていないと考えられる。
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