| 研究概要 |
シネフンギンは放線菌Streptomyces incarnatusが生産するヌクレオシド系抗生物質である。
Candida albicansに対する抗真菌活性を示すほか,トリパノゾーマ原虫にも有効でマラリアの特効薬としても期待されている。標識化合物の取り込み実験から,シネフンギンはL-アルギニンとATPから生成すると報告されている。その生合成にはピリドキサールリン酸(PLP)を補酵素とする酵素の関与が示唆されているが,酵素の実体はまったく明らかにされていない。L-アルギニンとATPを基質としてC-C結合を形成するPLP酵素はこれまでに報告がなく,シネフンギン生合成にはユニークな酵素が関与すると思われる。本研究ではシネフンギン生合成に関わる遺伝子をクローニングするために,放線菌用発現ベクターを用いて,シネフンギン生合成遺伝子(群)のスクリーニングを行う。昨年度までに,遺伝子発現ベクターpKU110の薬剤耐性マーカー(チオストレプトン耐性)をネオマイシン耐性遺伝子に変えたpTRA502の作製を行った。Streptomyces incarnatusのゲノム遺伝子を制限酵素Sau3AIで限定分解して5-6kbp程度の遺伝子断片に分画する条件検討を行った。制限酵素濃度や処理時間を変えて最適条件を検討した。アガロース電気泳動からDNAを抽出する過程においてDNAの回収が低い問題があったので,ゲルからの抽出・回収方法を種々のキットおよびキットの操作法について詳細に検討した結果,ガラスビーズに吸着させて回収するキットを用いて,撹拌を激しく長時間おこなうことにより,回収量と純度を大きく改善できた。さらに,回収した遺伝子とベクターとのライゲーション反応とそれに続く放線菌宿主Streptomyecs lividans TK24への形質転換を行ったが,組換えプラスミドを持った形質転換体の出現頻度が極めて低く,ショットガンクローニングを行うのに充分な形質転換効率が得られていない。この点についても,ライゲーションキットの選択や操作法の改良などを行っている。シネフンギン生合成能を獲得した形質転換株を選抜には,従来HPLCを用いてシネフンギンを同定しようとしてきたが,より短時間で高分解能の分析が行えるキャピラリー電気泳動を導入した。これにより一回の分析に40分程度時間を費やすHPLC分析から10分以内に分析が完了する上に,オートサンプラーによる操作の自動化が可能になり効率的なショットガンスクリーニングが可能になった。
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