研究課題/領域番号 |
14570185
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
研究分野 |
実験病理学
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研究機関 | 名古屋大学 |
研究代表者 |
村雲 芳樹 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (40324438)
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研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2003年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2002年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
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キーワード | REV1 / focus形成 / 紫外線照射 / 細胞内局在 / DNA損傷 / 損傷乗り越え型DNA合成 / REV3 / REV7 |
研究概要 |
本研究では、ヒトREV蛋白の細胞内局在の解析と、紫外線によるDNA障害が及ぼす影響について検討した。GFP融合REV1、REV3、REV7蛋白をそれぞれ発現させる発現ベクターを作成し、COS7細胞に導入することにより細胞内でそれぞれの蛋白を発現させ、蛍光顕微鏡にてそれらの蛋白の細胞内局在を観察した。その結果、REV1蛋白は核内に存在し、ある割合で数十個の小顆粒状のfocusを形成していること、REV7蛋白は大部分が核内に、一部が細胞質に存在し、focus形成は伴わないことが判明、REV3蛋白は核内に存在しているが、発現が悪いため詳細は不明であった。そこで、REV1にて特異的に認められたfocus形成に着目し、紫外線照射によるDNA損傷との関係を詳細に検討した。GFP融合REV1蛋白をCOS7細胞で強制発現させ、その細胞に紫外線照射によりDNA損傷を与えてREV1のfocus形成の変化を観察した。紫外線照射しない状態で約3%の細胞でfocus形成が認められたが、8J/m^2の紫外線照射8時間後には約25%の細胞でfocus形成が認められた。また、このfocus形成率は、紫外線量に依存して増加した。REV1のfocusはDNA複製forkの指標であるPCNAと共局在を示し、またBrdUを用いた解析により多くのfocusはS期で形成されていることが判明した。また損傷乗り越え型DNA複製に関与する他の蛋白Polκ、、Polηとの共局在も確認された。これらの結果より、REV1のfocus形成は紫外線照射により誘導され、しかもS期のDNA合成と関係している可能性が示唆された。REV1の種々のdeletion mutantを用いて、REV1のfocus形成に重要なドメインを決定したところ、REV1のC末端部分がfocus形成に重要であることが判明した。Polκ、Polη、REV7との結合ドメインの存在する部位であり、REV1がこれらの蛋白の機能に関与している可能性が示唆された。今後は他のDNA損傷誘発薬剤を用いた時のfocus形成についての検討、また、突然変異導入率についての検討を行う予定である。
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