| 研究課題/領域番号 |
14570249
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 甲子園大学 |
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研究代表者 |
松田 守弘 甲子園大学, 栄養学部, 教授 (20029771)
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| 研究分担者 |
堀口 安彦 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (00183939)
野中 泰樹 (の中 泰樹) 甲子園大学, 栄養学部, 教授 (80156215)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
2003年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2002年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
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| キーワード | 一本鎖組換え抗体 / 抗破傷風毒素抗体 / ヒト型モノクローナル抗体 / 中和抗体 |
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| 研究概要 |
中毒性感染症の治療・予防(非免疫者の)に必須の抗毒素は、ヒト免疫グロブリン製剤(抗破傷風だけ)や異種タンパク質のウマ抗毒素が実用されており、供給源、ウイルス感染の可能性や血清病などの問題がある。そこでヒト型で培養細胞由来のモノクローナル抗毒素(MAb)や、より経済的なその組換え抗毒素が望まれる。私たちは、最も研究が進んでいる破傷風抗毒素をモデルとして、私たちが樹立した理論的にも最高中和性の抗破傷風ヒト型MAb-G6を産生するハイブリドーマ株からMAb-G6の重鎖(H)及び軽鎖(K,κ鎖)の可変部の遺伝子(V_H, V_K)をクローニングし、これらをリンカー(L、[(Gly)4-Ser]n, n:1〜3を発現するヌクレオチド)で連結してファージミドCATAB 5Eに導入しファージディスプレイ法により一本鎖組換え抗体フラグメントScFv-G6(H-Ln-K,またはK-Ln-H)として、まず大腸菌株での発現系を確立した。至適条件下での遺伝子産物(H-L_1-K E tag, C末端にE tagを付加、抗E tagでELISA法により検出を可能)が、私たちの改良法を用いマウス毒性を完全中和(救命)することを初めて見出した。実用化のために、大量のScFv-G6を自然に近いtagなしの形で産生することを目指した結果、酵母Pochia pastorisとScFv-G6遺伝子導入ベクターpPIC9による発現系(まずScFv-G6 H-L_1-K(His)_6tag付、ついでtagなし)を確立することに成功した。より大量の発現系として、薬剤抵抗性遺伝子をもつpPIC9Kベクターを用いG418抵抗性をマーカーとして選択してScFv-G6遺伝子の多コピー組換え体Pichia pastoris株を分離することができ大腸菌系の300倍以上のScFv-G6を産生可能になり実用化の基礎ができた。
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