| 研究課題/領域番号 |
14570251
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 徳島文理大学 |
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研究代表者 |
櫻井 純 (桜井 純) 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (80029800)
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| 研究分担者 |
小林 敬子 徳島文理大学, 薬学部, 助手 (90170315)
永浜 政博 徳島文理大学, 薬学部, 助教授 (40164462)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2003年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2002年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | ウエルシュ菌 / イオタ毒素 / 二成分毒素 / ADPリボシル化 / オリゴマー / リピッドラフト / エンドサイトーシス / エンドソーム / ADPリボシル化酵素 / 結晶解析 / アミノ酸残基 / 部位特異的変異法 / ドメイン |
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| 研究概要 |
ADPリボシル化酵素の共通モチーフ以外の残基でla成分の触媒Cavity内、また、その周辺に存在するアミノ酸残基をアミノ酸置換しで、それぞれの酵素活性のカイネティク分析を行い、アミノ残基の役割を解析した。Y-246は、アクチンへのADPリボシル部の転移、Y-251は、NAD^+のCavity内への導入、N-255は、アクチンの認識、E-301は、触媒部位の構造維持、F-349は、NAD^+のニコチンリングの固定、R-352は、NAD^+のリン酸基の固定に働いていることを明らかにした。次に、la成分のlb成分との結合は、その立体構造を考慮し、lb成分を支持体に固定してBiacore分析すると、種々の変異la成分との結合の比較から、la成分の191-210残基領域あることが明らかとなった。lbをVero細胞とインキュベーション後、1%Triton X-100処理と不連続スクロース密度勾配超遠心法によって分析すると、lbは、Vero細胞のラフトに結合して7量体オリゴマーを形成することが判明した。Cy3ラベルlbの細胞への結合と侵入を蛍光顕微鏡で検討すると、Cy3ラベルlbは、時間に伴い細胞膜側からエンドソーム内への移行が認められ、抗lb抗体を用いた蛍光抗体法による解析でも、同様に、細胞内への侵入が認められた。加えて、lbの存在下、非存在下におけるNドメインと蛍光タンパク質であるGreen Fluorescent Protein(GFP)との融合タンパク質(laN-GFP)の解析によって、laは、lbと結合してエンドサイトーシスにより細胞内に侵入することが判明した。以上の結果から、イオタ毒素は、lbがVero細胞のラフトに存在するレセプターに結合後、オリゴマーを形成、そこにlaのNドメインが結合し、エンドサイトーシスにより細胞内に侵入して初期エンドソームへ移行すると推察される事が明らかとなった。
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