| 研究課題/領域番号 |
14571305
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
脳神経外科学
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
高見 剛 岐阜大学, 医学部, 教授 (70136943)
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| 研究分担者 |
齊尾 征直 (斉尾 征直) 岐阜大学, 医学部, 助教授 (40242721)
坂井 昇 岐阜大学, 医学部, 教授 (10021487)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
2003年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2002年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
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| キーワード | 腫瘍抗原ペプチド / HLA-A24 / ヒトグリオーマ細胞 / ヒスチジン標識キメラ蛋白 / 腫瘍免疫療法 / 抗体提示 / グリオーマ / MHC class Ia / β2ミクログロブリン / ペプチド / 分泌型 |
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| 研究概要 |
本研究は、腫瘍抗原ペプチドの効率的な解析方法を確立する目的で、培養腫瘍細胞株に分泌蛋白となるよう改変したHLA遺伝子を導入し、導入遺伝子産物が培養上清中に分泌され分離・精製可能か否かを検討したものである。このため、未だ予後不良であるヒト脳腫瘍を標的に、日本人に多いHLAの一つであるHLA-A24遺伝子の導入を検討した。既に精製済みのHLA-A24のcDNAを用い、その全長1098bp、膜貫通部から細胞質外配列部分1067bp、細胞質外部分881bpの3種の遺伝子をヒスチジン標識遺伝子に組み込み、HLA-A24陰性のヒト培養膠芽細胞株5種に導入した。その結果、SNB19とU373MGのヒト培養膠芽細胞株培養上清中にELISA法で検出可能なヒスチジン標識A24蛋白が検出された。すなわち、抗ヒスチジンタグ抗体コーティング・抗HLA抗体(W6/32)検出で反応する物質が、HLA-A24-1067bpおよびHLA-A24-881bp導入SNB19とU373MGの4種で検出された。なかでも、HLA-A24-1067bp導入U373MG(U373-A24-1067と命名)の培養上清で反応が強く、これを用いて以下の解析を行った。免疫組織化学ではA24に対する抗体、A11.1Mとの陽性反応はみられなかったが、抗ヒスチジン抗体では未処理U373MGに比し明らかな陽性反応がみられ、導入遺伝子の発現があるものと考えられた。U373-A24-1067の培養上清にはコバルトアフィニティーカラムで精製され、SDS-PAGE/western blottingで約42kDaの抗ヒスチジン抗体ならびにW6/32と反応するたんぱく質が検出された。このアフィニティーカラム精製分画には抗β2m抗体と反応する分子量約12kDaの蛋白も含まれることから、1067bpのA24遺伝子産物がβ2mと会合して分泌されていると考えられた。以上のように、本研究はβ2mを会合したHLA-A24を培養上清中に分泌させ、大量に精製する方法を確立することに成功した。この成果は腫瘍抗原ペプチドの解明と、腫瘍免疫療法の発展に貢献するものである。
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