| 研究課題/領域番号 |
14572032
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
物理系薬学
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
植田 正 九州大学, 大学院・薬学研究院, 教授 (90184928)
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| 研究分担者 |
出原 賢治 佐賀大学, 医学部, 教授 (00270463)
井本 泰治 崇城大学, 工学部, 教授 (90038282)
阿部 義人 九州大学, 大学院・薬学研究院, 助教授 (60315091)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2003年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2002年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
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| キーワード | 核磁気共鳴 / インターロイキン13 / 緩和解析 / アレルギー / 安定同位体ラベル / 核磁気共鳴法 / チオレドキシン / NMR |
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| 研究概要 |
Hisが6個連結したC末端側にエンテロキナーゼ切断配列を挿入し、さらにそのC末側にインターロイキン13(IL13)が発現するような遺伝子を含むプラスミド構築した。並行して、IL13のArg110がGln変異する遺伝子を含むプラスミドを構築した。いずれのプラスミドも、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体を唯一の窒素源として、^<15>NH_4Clを含む培地で培養し、封入体として融合タンパク質を得た。それぞれの封入体を6Mグアニジンで可溶化し、Niアガロースカラムを利用して、それぞれのタンパク質を粗精製した。粗精製物を一端50mMのメルカプトエタノールで還元し、3M尿素、30%グリセロール、5mMシスタミン及び5mMシステインを含むpH8.5トリス塩酸緩衝液中で再生を行った。再び、Niアガロースカラムで精製したのち、精製物をエンテロキナーゼ消化を行い、融合タンパク質から数残基のHis及びエンテロキナーゼ切断配列を除去し、IL13を得た。その後、カチオン交換樹脂にて精製し、野生型IL13及び変異型IL13(Arg110Gln)を得た。それぞれが正しいIL13の構造を持っていることは^1H-^<15>N HSQCスペクトルにより確認した。野生型と変異型の各残基の動的挙動を調べるために、主鎖のN-Hシグナルの縦緩和、横緩和定数及びNOEを測定した。これらのデータに基づき、モデルフリーアナリシスを行って、オーダーパラメーター、Rex(いずれも内部運動の指標)を算出した。これらを野生型と変異型で比較したところ、IL13のDヘリックス領域に動きの違いが見られた。この領域は、変異体解析によりIL13が受容体と結合する部分であると推定されているので、変異体が野生型にべ、IL13受容体との結合力がわずかに低い理由が、分子運動の違いによることが示唆された。
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