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核磁気共鳴を用いたインターロイキン13遺伝子変異体のアレルギー反応増強機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 14572032
研究種目

基盤研究(C)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 物理系薬学
研究機関九州大学

研究代表者

植田 正  九州大学, 大学院・薬学研究院, 教授 (90184928)

研究分担者 出原 賢治  佐賀大学, 医学部, 教授 (00270463)
井本 泰治  崇城大学, 工学部, 教授 (90038282)
阿部 義人  九州大学, 大学院・薬学研究院, 助教授 (60315091)
研究期間 (年度) 2002 – 2003
研究課題ステータス 完了 (2003年度)
配分額 *注記
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2003年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2002年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
キーワード核磁気共鳴 / インターロイキン13 / 緩和解析 / アレルギー / 安定同位体ラベル / 核磁気共鳴法 / チオレドキシン / NMR
研究概要

Hisが6個連結したC末端側にエンテロキナーゼ切断配列を挿入し、さらにそのC末側にインターロイキン13(IL13)が発現するような遺伝子を含むプラスミド構築した。並行して、IL13のArg110がGln変異する遺伝子を含むプラスミドを構築した。いずれのプラスミドも、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。形質転換体を唯一の窒素源として、^<15>NH_4Clを含む培地で培養し、封入体として融合タンパク質を得た。それぞれの封入体を6Mグアニジンで可溶化し、Niアガロースカラムを利用して、それぞれのタンパク質を粗精製した。粗精製物を一端50mMのメルカプトエタノールで還元し、3M尿素、30%グリセロール、5mMシスタミン及び5mMシステインを含むpH8.5トリス塩酸緩衝液中で再生を行った。再び、Niアガロースカラムで精製したのち、精製物をエンテロキナーゼ消化を行い、融合タンパク質から数残基のHis及びエンテロキナーゼ切断配列を除去し、IL13を得た。その後、カチオン交換樹脂にて精製し、野生型IL13及び変異型IL13(Arg110Gln)を得た。それぞれが正しいIL13の構造を持っていることは^1H-^<15>N HSQCスペクトルにより確認した。野生型と変異型の各残基の動的挙動を調べるために、主鎖のN-Hシグナルの縦緩和、横緩和定数及びNOEを測定した。これらのデータに基づき、モデルフリーアナリシスを行って、オーダーパラメーター、Rex(いずれも内部運動の指標)を算出した。これらを野生型と変異型で比較したところ、IL13のDヘリックス領域に動きの違いが見られた。この領域は、変異体解析によりIL13が受容体と結合する部分であると推定されているので、変異体が野生型にべ、IL13受容体との結合力がわずかに低い理由が、分子運動の違いによることが示唆された。

報告書

(3件)
  • 2003 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2002 実績報告書
  • 研究成果

    (9件)

すべて 2004 その他

すべて 雑誌論文 (4件) 文献書誌 (5件)

  • [雑誌論文] Identification of the region in Escherichia coli DnaA protein required for specific recognition of the DnaA box.2004

    • 著者名/発表者名
      Yoshida et al.
    • 雑誌名

      Cell.Mol.Life Sci. 60(9)

      ページ: 1998-2008

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] A small chimerically bifunctional monomeric protein : Tapes japonica lysozyme.2004

    • 著者名/発表者名
      Takeshita et al.
    • 雑誌名

      Cell.Mol.Life Sci. 60(9)

      ページ: 1944-1951

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] Identification of the region in Escherichia coli DnaA protein required for specific recognition of the DnaA box.2004

    • 著者名/発表者名
      Yoshida et al.
    • 雑誌名

      Cell.Mol.Life.Sci. 60

      ページ: 1998-2008

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [雑誌論文] A small chimerically bifunctional monomeric protein : Tapes Japonica lysozyme.2004

    • 著者名/発表者名
      Takeshita et al.
    • 雑誌名

      Cell.Mol.Life Sci. 60

      ページ: 1944-1951

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yoshida et al.: "Identification of the region in Escherichia Coli DnaA protein required for specific recognition of the DnaA box."Cell.Mol.Life Sci.. 60(9). 1998-2008 (2003)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書
  • [文献書誌] Obita et al.: "Solution structure and activity of mouse lysozyme"Cell.Mol.Life Sci.. 60(1). 176-183 (2003)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書
  • [文献書誌] Ohkuri et al.: "A metal binding in the polypeptide chain improves the folding efficiency of a denatured and reduced protein"Biopolymers. 64・2. 106-114 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Obita et al.: "Determination of the secondary structure in solution of the Escherichia coli DnaA DNA-binding domain"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 299・1. 42-48 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Ohmura et al.: "Fluctuations in free or substrate-complexed lysozyme and a mutant of it detected on x-ray crystallography and comparison with those detected on NMR"J.Biochem.. 131・5. 701-704 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書

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公開日: 2002-04-01   更新日: 2016-04-21  

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