血液疾患でのスフィンゴシン1リン酸の意義とスフィンゴシンキナーゼの発現調節の解明

• 研究課題/領域番号: 14572180
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 病態検査学
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 村手 隆 名古屋大学, 医学部, 教授 (30239537)
• 研究分担者: 小泉 恵子 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (00118027) ; 高木 明 名古屋大学, 医学部, 助手 (30135371) ; 小嶋 哲人 名古屋大学, 医学部, 教授 (40161913) ; 坂野 喜子 岐阜大学, 医学部, 助教授 (50116852) ; 鈴木 元 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (80236017)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2003年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2002年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
• キーワード: スフィンゴシンキナーゼ1 / ポリクローナル抗体 / 転写調節 / プロモーター解析 / MEG-O1 / プロモータ解析 / スフィンゴシンキナーゼ

研究概要

ヒトスフィンゴシンキナーゼ1のアミノ酸配列でC末端に近い部分からペプチドを合成し,ウサギに免疫後,抗原カラムにて精製してポリクローナル抗体を作成した.作成した抗体をWestern blottingや免疫組織染色でその有用性を検討した.Western blottingでは予想された分子量の単一バンドが認められ有用性が確認できた.現在この抗体を用いて解析を行っている.次ぎにヒト巨核芽球性白血病細胞株MEG-O1のPMA刺激時のスフィンゴシンキナーゼ1のメッセージレベル,酵素活性,タンパクレベルを解析し,スフィンゴシンキナーゼ1遺伝子5'側のプロモーター領域の解析でPMA反応に必須領域の同定ならびに結合転写因子の解明を試みた.我々の実験から(1)PMAはSPHK1遺伝子の転写を誘導する(2)MEG-O1細胞にhSPHK1遺伝子の転写開始点は少なくとも2つ存在する(3)PMAで刺激される転写で、プロモーター活性はファーストエクソンの5'プロモーター領域とファーストイントロンに各々存在する事が明かとなった.コンピューター解析で4つ(AP4,two AP-2,Sp1)のPMA関連転写因子結合部位を想定し,この予想転写因子結合部位を正確に取り除くあるいは予想転写因子結合部位にミューテーション入れた様々なレポーターコンストラクトを作成した。結果,PMA反応性は、遺伝子5'側のSp1と2つのAP-2結合サイトで十分である事が示された。EMSAの解析においても,Sp1結合部位とAP-2結合部位はSPHK1遺伝子発現のPMA反応性を決定するPMA誘導性転写因子結合部位であることが示された。

研究成果

• [文献書誌] Terada N. et al.: "Compartmentation of the mouse cerebellar cortex by spningosine kinase"J Comparative Neurol. 469. 119-127 (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nakada Y. et al.: "Regulation of spingosine kinase 1 gene expression by protein kinase C in a hyman leukemia cell line, MEG-O1."Biochim Biophys Acta. 1635. 104-116 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Furuta M. et al.: "A novel platinum compound inhibits telomerase activity in vitro and reduces telomere length in a human epatoma cell line"Int J Cancer. 104. 709-715 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Limsirichaikul S. et al.: "The Gly-952 residue of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase alpha is important in discriminating correct deoxyribonucleotides from incorrect ones."J Biol Chem. 278. 19079-19086 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Aoki E.et al.: "Expression levels of DNA methyltransferase genes do not correlate with P15INK4B gene methylation in myelodysplastic Syndromes."Leukemia. 17. 1903-1904 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Murate T. et al.: "Up-regulation of acid sphingomyelinase during retinoic acid-induced myeloid differentiation of NB4, a human acute promyelocytic leukemia cell line"J Biol Chem. 277. 9936-9943 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Terada N.et al.: "Compartmentation of the mouse cerebellar cortex by sphingosine kinase"J Comparative Neurol. 469. 119-127 (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nakade Y.et al.: "Regulation of sphingosine kinase 1 gene expression by protein kinase C in a human leukemia cell line, MEG-01"Biochim Biophys Acta. 1635. 104-116 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Furuta M.et al.: "A novel platinum compound inhibits telomerase activity in vitro and reduces telomere length in a human hepatoma cell line."Int J Cancer. 104. 709-715 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Limsirichaikul S.et al.: "The Gly-952 residue of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase alpha is important in discriminating correct deoxyribonucleotides from incorrect ones."J Biol Chem. 278. 19079-19086 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Aoki E.et al.: "Expression levels of DNA methyltransferase genes do not correlate with p15INK4B gene methylation in myelodysplastic syndromes."Leukemia. 17. 1903-1904 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Murate T.et al.: "Up-regulation of acid sphingomyelinase during retinoic acid-induced myeloid differentiation of NB4, a human acute promyelocytic leukemia cell line."J Biol Chem. 277. 9936-9943 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Terada N. et al.: "Compartmentation of the mouse cerebellar cortex by sphingosine kinase"J Comparative Neurol. 469. 119-127 (2004)
• [文献書誌] Nakade Y. et al.: "Regulation of sphingosine kinase 1 gene expression by protein kinase C in a human leukemia cell line, MEG-O1"Biochim Biophys Acta. 1635. 104-116 (2003)
• [文献書誌] Furuta M. et al.: "A novel platinum compound inhibits telomerase activity in vitro and reduces telomere length in a human hepatoma cell line"Int J Cancer. 104. 709-715 (2003)
• [文献書誌] Limsirichaikul S. et al.: "The Gly-952 residue of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase alpha is important in discriminating correct deoxyribonucleotides from incorrect ones"J Biol Chem. 278. 19079-19086 (2003)
• [文献書誌] Suyama T. et al.: "The MAGE-Al gene expression is not determined solely by methylation status of promoter region in meinatological malignuncies"Leuk Res. 12. 1113-1118 (2002)
• [文献書誌] Igarashi T. et al.: "Factors affecting toxicity, responce and progression-free surviveal in relpsed patients with indolent B-cell lymphoma and mintle cell lymphoma"Ann Oncol. 13. 928-943 (2002)
• [文献書誌] Takagi A. et al.: "Involvement of caspase 3 mediated apoptosis in hematopoietic cytotoxicity of metabolites of ethylene glycol monomethyl ether"Industrial Health. 40. 371-374 (2002)
• [文献書誌] Hurate T. et al.: "Up-regulation of acid sphingomyelinase during retinoic acid-induced myeloid differentiation of NB4, a human acute promyelocytic leukemia cell line"J. Biol. Chem. 277. 9936-9943 (2002)