| 研究課題/領域番号 |
14580616
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物有機科学
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 (2003-2004)
大阪市立大学 (2002) |
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研究代表者 |
城 宜嗣 (2003-2004) 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 主任研究員 (70183051)
松永 勇 (2002) 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 講師 (00254425)
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| 研究分担者 |
杉本 宏 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 研究員 (90344043)
金 美沙 独立行政法人理化学研究所, 城生体金属科学研究室, 基礎科学特別研究員 (40373295)
城 宣嗣 理化学研究所, 生体物理化学研究室, 主任研究員 (70183051)
小倉 壽 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (10115222)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2004年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2003年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2002年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | チトクロムP450 / 脂肪酸水酸化 / 過酸化水素 / ヘム酵素 / 酸素添加反応 / X線結晶構造解析 / シトクロムP450 / ペルオキシゲナーゼ / ペルオキシダーゼ / モノオキシゲナーゼ / 反応機構 / 脂肪酸 |
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| 研究概要 |
過酸化水素を特異的且つ非常に効率よく利用し、脂肪酸のカルボキシル基近くの炭素原子(α位又はβ位)に過酸化水素の酸素原子を導入する、Bacillus subtilis由来のシトクロムP450(P450_<BSβ>について、その反応機構と動的構造の関連を明らかにする事を目的として研究を行った。この酵素(鉄三価)の基質(パルミチン酸)結合型の単結晶を得る事に成功し、さらに結晶構造を明らかにした。この構造を基に、いくつかの変異体を作成し、それらの活性測定や分光測定を行った。これらの結果を基に、酵素反応における活性中心近傍のいくつかのアミノ酸残基の役割(基質認識、触媒基、反応部位認識など)を明らかにした。その上で、本酵素による脂肪酸水酸化の分子機構を提案した。基質認識機構をより詳細に明らかにするために、基質の結合していない酵素の結晶化を目指し、その精製法(ゲル濾過による持ち込みの基質除去、過酸化水素との反応により生成物として除去する)を検討した。しかし、基質非結合型酵素の結晶は得られなかった。また、鉄に結合した配位子と基質との相互作用を調べる目的で、基質結合型Fe^<3+>酵素の結晶を、窒素雰囲気下、母液中でNa_2S_2O_4により還元した後に一酸化炭素(CO)をソーキングして、Fe^<2+>CO型酵素を調製しその構造解析を行った。COが鉄に結合する事により、Phe79が動いたが、それ以外には基質、ヘリックスなどの移動は見られなかった。以上の結果を基に、酵素反応中間体結晶構造解析を目指し、結晶中でFe^<2+>O_2型酵素の生成を試みた。顕微分光解析では部分的ではあるが酸素化型の精製は確認できた。過酸化水素を基質とするヘム酵素の反応機構に関して、比較考察した。
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