| 研究課題/領域番号 |
14580640
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
佐上 郁子 東北大学, 多元物質科学研究所, 講師 (10143033)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2003年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2002年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | 一酸化窒素合成酵素 / カルモデュリン / カベオリン / 情報伝達 / 部位特異的変異体 / 蛋白-蛋白相互作用 / 自己阻害配列 |
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| 研究概要 |
神経型一酸化窒素合成酵素nNOSの機能ドメインとカルモジュリン(CaM)、カベオリンなどの生体分子によるNOSの反応の制御機構を解明するために、nNOSの変異体を作成し、分子内電子伝達機構を解析をおこなった。さらにnNOSの機能ドメインとCaMあるいはカベオリンの反応に対する効果を解析した。さらにラットカベオリンの大腸菌での発現系を構築し、GST融合タンパク質あるいはHis-tag付きのタンパク質として発現、精製した。これらの精製タンパク質を用いて、タンパク-タンパク間相互作用を検討した。
その結果(1)カベオリンのscaffolding domainのペプチド(CaV1p1)の完全長のnNOSの活性に対する効果を調べたところ、CaV1p1は濃度依存的に(IC50=1.8μM)CaMに依存するNO合成活性とNADPH酸化活性を阻害するが、この阻害はCaMの過剰量の添加によって部分的に拮抗された。(2)次に、nNOSに存在する推定カベオリン結合配列中に保存されているアミノ酸(F584、W587)の変異体を作成し、CaV1p1阻害効果を調べたところ、変異体でもカベオリンペプチドによる活性阻害が見られた。したがって、血管内皮細胞型NOS(eNOS)の場合と異なり、nNOSは推定結合配列以外の部位でもカベオリンと相互作用することが示唆された。(3)また、還元酵素ドメインのシトクロームc還元活性はCaV1p1によって90%以上阻害されるのに対し、フェリシアン化カリウム還元活性は50%未満しか阻害されなかった。このことから、カベオリンペプチドは、nNOSではNADPHからFADまでの電子移動に影響せずFADからFMNさらにFNMからヘムへの電子移動を阻害すると考えられる。(4)免疫沈降法等により、カベオリンはnNOSのオキシゲナーゼドメインのみおよび還元酵素ドメインのみと結合出来ることがわかった。(5)さらにnNOS還元酵素ドメインの種々の欠失変異体を作成し、カベオリンとの相互作用を検討したところ、相互作用にはFMNドメインのみで充分であることがわかった。以上のことから、nNOSの血管内皮型のeNOSの場合と異なる活性制御様式が明らかになった。
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