新規コレステロール結合プローブを用いた細胞内ラフトの可視化システムの構築

• 研究課題/領域番号: 14580660
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 機能生物化学
• 研究機関: (財)東京都高齢者研究・福祉振興財団
• 研究代表者: 林 昌美 (財)東京都高齢者研究・福祉振興財団, 東京都老人総合研究所・生体膜機能研究グループ, 研究助手 (00192279)
• 研究分担者: 岩下 淑子 財団法人東京都高齢者研究, 福祉振興財団・東京都老人総合研究所・生体膜機能研究グループ, 副参事研究員 (50111498)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円); 2003年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2002年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
• キーワード: コレステロール / 脂質ラフト / コレステロール結合毒素 / 可視化 / マイクロドメイン / 繊維芽細胞 / 緑色蛍光蛋白質 / ラフト / 線維芽細胞 / 脂質マイクロドメイン / 脂質ミクロドメイン / MDCK細胞

研究概要

我々は、これまでに、コレステロールに特異的に結合する毒素(θ毒素)を改変、無毒化することによってコレステロールに特異的なプローブ(BCθ)を作製し、BCθが脂質ミクロドメイン(ラフト)中のコレステロール密度の高い領域に選択的に結合することを見いだしている。さらに、BCθが細胞表面ラフトの可視化に有用であることを明らかにしている。そこで、本研究では、細胞表面及び細胞内ラフトの同時可視化を目指して、細胞内ラフトの可視化系の構築を進めた。まず、θ毒素の構造-機能相関の解析から、毒素のC末端のドメイン(D4)がコレステロールへの結合能を担う部位であること、及びラフトへの選択的結合能を担っていることを明らかにした。この結果をふまえ、次に、D4と緑色蛍光蛋白質(Enhanced green fluorescent protein ; EGFP)との融合蛋白質(EGFP-D4)遺伝子を作製して、大腸菌内でEGFP-D4蛋白質を生合成させ、これを精製してその性質を調べた。その結果、EGFP-D4はコレステロールに対する特異的結合能およびラフトへの選択的結合能を保持していることが確認された。そこで、次に、動物細胞内へのEGFP-D4遺伝子の導入を行った。テトラサイクリンの除去で目的遺伝子の発現が誘導されるように設計されたベクターにEGFP-D4遺伝子を組み込み、マウス線維芽細胞に導入した。薬剤耐性を指標に遺伝子導入細胞を選択的に増殖させ、EGFP-D4蛋白質の発現量の異なる幾つかのクローンを得た。細胞内でのプローブの局在を調べたところ、一部の細胞内小胞に強い染色が認められ、生化学的な解析の結果とあわせて細胞内ラフトへの結合が示唆された。現在、この膜小胞の同定を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Ohno-Iwashita, Y.et al.: "Perfringolysin O, a cholesterol-binding cytolysin, as a probe for lipid rafts"Anaerobe. 10(2). 125-134 (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Reid, P.C.et al.: "A novel cholesterol stain reveals early neuronal cholesterol accumulation in the Niemann-Pick type C1 mouse brain"J.Lipid Res.. 45(3). 582-591 (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Aoki, T.et al.: "Sequestration of cross-linked membrane molecules to caveolae in two different pathways"Acta Histochemica et Cytochemica. 36(2). 165-171 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sugii, S.et al.: "Biotinylated theta toxin derivative as a probe to examine intracellular cholesterol-rich domains in normal and Niemann-Pick type C1 cells"J.Lipid Res.. 44(5). 1033-1041 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Moebius, W.et al.: "Recycling compartments and the internal vesicles of multivesicular bodies harbor most of the cholesterol found in the endocytic pathway"Traffic. 4. 222-231 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Shimada, Y.et al.: "The C-terminal domain of perfringolysin O is an essential cholestereol-binding unit targeting to cholesterol-rich microdomains"Eur.J.Biochem.. 269(24). 6195-6203 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ohno-Jwashita, Y. et al.: "Perfringolysin O, a cholesterol-binding Cytolysin, as a probe for lipid rafts."Anaerobe. 10(2). 125-134 (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Reid, P.C.et al.: "A novel cholesterol stain reveals early neuronal cholesterol accumulation in the Niemann-Pick type C1 mouse brain."J. Lipid Res.. 45(3). 582-591 (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Aoki, T. et al.: "Sequestration of cross-linked membrane molecules to caveolae in two different pathways."Acta Histochemica et Cytochemica. 36(2). 165-171 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sugii, S. et al.: "Biotinylated theta toxin derivative as a probe to examine intracellular cholesterol-rich domains in normal and Niemann-Pick type C1 cells."J. Lipid Res.. 44(5). 1033-1041 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Moebius, W. et al.: "Recycling compartments and the internal vesicles of multivesicular bodies harbor most of the cholesterol found in the endocytic pathway."Traffic. 4. 222-231 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Shimada, Y. et al.: "The C-terminal domain of perfringolysin O is an essential cholesterol-binding unit targeting to cholesterol-rich microdomains."Eur.J.Biochem.. 269(24). 6195-6203 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ohno-Iwashita, Y. et al.: "Perfringolysin O, a cholesterol-binding cytolysin, as a probe for lipid rafts"Anaerobe. 10(2). 125-134 (2004)
• [文献書誌] Reid, P.C.et al.: "A novel cholesterol stain reveals early neuronal cholesterol accumulation in the Niemann-Pick type C1 mouse brain"J.Lipid Res.. 45(3). 582-591 (2004)
• [文献書誌] Aoki, T. et al.: "Sequestration of cross-linked membrane molecules to caveolae in two different pathways"Acta Histochemica et Cytochemica. 36(2). 165-171 (2003)
• [文献書誌] Sugii, S. et al.: "Biotinylated theta toxin derivative as a probe to examine intracellular cholesterol-rich domains in normal and Niemann-Pick type C1 cells"J.Lipid Res.. 44(5). 1033-1041 (2003)
• [文献書誌] Heijnen, H.F.G.et al.: "Concentration of rafts in platelet filopodia correlates with recruitment of c-Src and CD63 to these domains"J.Thrombosis and Haemostasis. 1(6). 1161-1173 (2003)
• [文献書誌] Moebius, W. et al.: "Recycling compartments and the internal vesicles of multivesicular bodies harbor most of the cholesterol found in the endocytic pathway"Traffic. 4. 222-231 (2003)
• [文献書誌] Shimada, Y. et al.: "The C-terminal domain of perfringolysin O is an essential cholestereol-binding unit targeting to cholesterol-rich microdomains"Eur. J. Biochem.. 269(24). 6195-6203 (2002)
• [文献書誌] Terashita, A. et al.: "Lipid binding activity of a neuron-specific protein NAP-22 studied in vivo and in vitro"J. Neurosci. Res.. 70(2). 172-179 (2002)
• [文献書誌] Kokubo, H. et al.: "Ultrastructural localization of flotillin-1 to cholesterol-rich membrane microdomains, rafts, in rat brain tissue"Brain Res.. 965(1-2). 83-90 (2003)
• [文献書誌] 嶋田有紀子, 岩下淑子: "コレステロールから視た膜機能ドメイン-コレステロールを見分けるプローブの開発"生化学. 74(7). 547-551 (2002)