新規な銅シャペロンの探索・機能解析と応用

• 研究課題/領域番号: 14655302
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物・生体工学
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 中山 亨 東北大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (80268523)
• 研究分担者: 邊見 久 東北大学, 大学院・工学研究科, 助手 (60302189) ; 西野 徳三 東北大学, 大学院・工学研究科, 教授 (90005827)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2003年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2002年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
• キーワード: シャペロン / オーロン / フラボノイド / 銅 / 翻訳後修飾 / プロセシング / ポリフェノール / オキシダーゼ

研究概要

銅シャペロンと推定されるタンパク質と相同性のあるORF遺伝子AmDDを含むcDNAが単離した.AmDDのアミノ酸配列解析により,54-110位および136-178位の2ヶ所にheavy metal associated domainの保存配列とよく一致する領域が存在することが分かった.これらを踏まえて,AmDDがCuの取り込みを補助し,AmAS1の活性化に関与するのではないかと推定した.pESC Yeast Epitope Tagging vectorを用いて,AmAS1とAmDDを共発現するプラスミドを構築した.AmDDまたはAmAS1の一方のみを含むプラスミド(pESC-DD,pESC-ASfull,pESC-ASΔN,pESC-ASΔC,pESC-ASΔNC)で形質転換した酵母をコントロールとして,共発現プラスミド(pESC-DD-ASfull,pESC-DD-ASΔN,pESC-DD-ASΔC,pESC-DD-ASΔNC)で形質転換した酵母の破砕液を粗酵素として,酵素アッセイを行った.しかし,コントロールと比較して反応生成物の顕著なピークを検出することはできなかった.粗酵素液の添加量および反応時間を増やしても,同様の結果が得られた.抗AmAS抗体を用いたウェスタンブロット発現解析を行った結果,発現タンパクの推定分子量(AmAS1 full;64kDa,AmAS1ΔN;57kDa,AmAS1ΔC;47kDa,AmAS1ΔNC;41kDa)と一致した単一のバンドを検出することができ,目的のタンパク質が発現していることが確認できた(Data Not Shown).ただし,SDS-PAGEで分析した後,クマシー染色を行ったところ,コントロールと比較して顕著なバンドの差は見られなかった.

研究成果

• [文献書誌] Suzuki, H., et al.: "cDNA cloning and characterization of two Dendranthema × morifolium anthocyanin acyltrans ferases"Plant Science. 166. 89-96 (2004)
• [文献書誌] Kulakova, L., et al.: "Cold-active esterase from Psychrobacter sp Ant300"Biochim.Biophys.Acta. 1696. 59-65 (2004)
• [文献書誌] Noguchi, A., et al.: "Deciphering the molecular basis of the broad substrate specificity of α-glucosidase"J.Biochem.. 134. 543-550 (2003)
• [文献書誌] Hemmi, H., et al.: "Fusion-type lycopene β-cyclase from a thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 305. 586-591 (2003)
• [文献書誌] Noguchi, A., et al.: "Altering the substrate chain-length specificity of an α-glucosidase"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 304. 684-690 (2003)
• [文献書誌] Suzuki, H., et al.: "Proposed mechanism and functional amino acid residues of malonyl-CoA : anthocyanin 5-O-glucoside malonyltransferase"Biochemistry. 42. 1764-1771 (2003)
• [文献書誌] Suzuki, T. et al.: "Cloning, heterologous Expression, renaturation and characterization of a cold-adapted esterase"Protein Expression and Purification. (印刷中). (2003)
• [文献書誌] Kurakova, L.et al.: "Improvement of thermostability of cold-active serine alkaline protease from the psychrotrophic bacterium"J. Mol. Cat. B : Enzymatic. (印刷中). (2003)
• [文献書誌] Suzuki, H. et al.: "Proposed mechanism and functional amino acid residues of molonyl-CoA : anthocyanin 5-0-glucoside"Biochemistry. (印刷中). (2003)
• [文献書誌] Tsuruoka, N. et al.: "Collagenolytic serine-carboxyl proteinase form Alicyclobacillus sendaiensis strain NTAP-1"Appl. Environ. Microbiol.. 69. 162-169 (2003)
• [文献書誌] Suzuki, H. et al.: "cDNA cloning, heterologous expressions, and functional characterization of malonyHltransferase"Plant Physiol.. 130. 2242-2151 (2002)
• [文献書誌] Hemmi, H. et al.: "Change of product specificity of hexaprenyl diphosphate synthase from Sulfolobus solfataricus"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 297. 1096-1101 (2002)