| 研究課題/領域番号 |
14657069
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| 研究種目 |
萌芽研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 香川大学(医学部) |
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研究代表者 |
岡部 昭延 香川大学, 医学部, 教授 (20093677)
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| 研究分担者 |
玉井 栄治 香川大学, 医学部, 助手 (40333512)
宮田 茂 香川大学, 医学部, 助手 (90314913)
松下 治 香川大学, 医学部, 助教授 (00209537)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2003年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2002年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
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| キーワード | Clostridium perfringerns / ウエルシュ菌 / クロストリジウム / 発現ベクター / フェレドキシン / ベントDNA / シアリダーゼ / コラゲナーゼ / Clostridium perfringens / Ferredoxin gene / Expression vector / Sialidase / Collagenase / Transcriptional fusion / Phased A-tracts / Curved DNA |
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| 研究概要 |
ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)のフェレドキシン遺伝子のプロモーターの上流域からプロモーター内部にかけて存在する5つの連続するPhased A-tractsは、新しいタイプのBent DNAであり、その折れ曲がり角度は110°と強い。上流3つのA-tractsと下流2つのA-tractsの相乗作用によりフェレドキシンのプロモーターを活性化することを明らかにした。この特殊なベント・プロモーターをC.perfringens/Escherichia coliのシャトル・ベクター兼プロモーター選択ベクターであるpPSVにクローン化し、高発現ベクターpFFを構築した。C.perfringens/pFF系の有用性を調べるために、C.perfringensの75kDaのシアリダーゼ(NanI)の構造遺伝子とpFFをTranscriptional fusionし、pFFNを構築した。対照として、nanI遺伝子の全領域を組み込んだベクターpPSVNを構築した。さらにAT-rich遺伝子の高発現系として開発されたE.coli BL21(DE3)CodonPlus-RILにおけるNanI産生能と比較するために、pUC19にnanIをクローン化した。C.perfringes/pFFNは、C.perfringens/pPSVNの60倍、大腸菌系の約15倍の産生を示した。培養液100mlから2段階精製法で約3mgの高純度のNanIが精製された。以上のことから、C.perfringens/pFF系はシアリダーゼの高発現系に有用であることが明らかとなった。pFFの有用性について、120kDaのコラゲナーゼ遺伝子についても同様に検討したところ、発現量の改善は見られたが、C.perfringens菌そのものを培養した時と同様に、分解産物も認められた。コラゲナーゼ産生のためには、今後Protease欠損の変異株の利用や培養条件などについて検討する必要があることが明らかとなった。
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