長DNA断片クローニング技術の開発

• 研究課題/領域番号: 14657426
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 産婦人科学
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 加藤 秀則 九州大学, 大学病院, 講師 (60214392)
• 研究分担者: 和氣 徳夫 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (50158606)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2003年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2002年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
• キーワード: 長DNA断片 / テロメアー / psoraren / 光架橋 / STSプライマー / 1番染色体 / DT40 / homologous recombination

研究概要

(1)テロメアベクターの試作
テロメアー繰り返し配列を1Kbもったベクターにこの領域内に存在するD1S437、D1S459それぞれのSTSマーカーをプライマーとしてPCRで増幅したDNA断片(5Kb)を組み込んだ。homologous recombinationの頻度の高いchikenDT40細胞にヒト1番染色体を微小核融合で導入したうえでこのベクターをターゲッティングし細胞の増殖を行うことにより、特定のSTSマーカーより遠位側と近位側の欠失をもった1番染色体断片を作製し得るかどうか検討した。その結果は期待どうりの染色体欠失を惹起できたものは10%以下であった。近年テロメアの機能に関連するいくつかの蛋白コンポーネントが明らかとなりつつあり、これらとの関連でベクターを改良したいと考える。また紡錘糸形成と染色体分裂に関するテロメアの動態なども検討した上でさらに発展させることも肝要と考えられた。
(2)光架橋プライマーによる増幅
D1S437、D1S459等種々のSTSマーカーをsense,antisenseともpsoraren付着型で合成すした。ヒト1番染色体をもつマウスA9細胞よりDNAを抽出し、変性した後これらのプライマーをアニールさせる。その後長波長紫外線で処理しプライマーをDNAに架橋し強固に固着させる。これをDNA polymeraseで処理しプライマー間を伸張させた。この際NTPとしてdigoxigenin-dUTPを取り込ませる。その後変性を行い、一本差分解酵素(exonucleaseIII,Bal31)を用いて変性DNAを分解した。両端に架橋プライマーをもつ伸張DNAは分解されないと考えられるので、この後digoxigenin抗体でつり上げ精製した。この系はおおむね作動することが分かったが、我々の条件ではDNA polymeraseであまり長い断片は合成されず、またdigoxigenin抗体でのつりあげもあまり効率が良くなくこの回収方法とともに両者の改良が必要と考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Asanoma K et al.: "NECC1, a candidate choriocarcinoma suppressor gene which encodes homeodomain consensus motif."Genomics. 81. 15-25 (2003)
• [文献書誌] Yamayoshi A et al.: "Photodynamic antisense therapy : regulation of cervical carcinoma cells by psoralen-conjugated oligonucleotides."Nucleic Acid Research Supplement. 3. 75-76 (2003)
• [文献書誌] Matsuda T et al.: "Genetics and molecular markers in gestational trophoblastic disease with special reference to their clinical application."Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynecology. 17,6. 827-836 (2003)
• [文献書誌] Kato K et al.: "Contribution of estrogen receptors (ERα) to oncogenic K-Ras-mediated NIH3T3 cell transformation and its implication for escape from senescence by modulating the p53 pathway"Journal of Biological Chemistry. 277,13. 11217-11224 (2002)
• [文献書誌] Kato H et al.: "Growth-associated Gene Expression Profiles by Microarray Analysis of Trophoblast of Molar Pregnancies and Normal Villi"International Journal of Gynecological Pathology. 21,3. 255-260 (2002)
• [文献書誌] Zhou Y et al.: "Identification of FOXC1 as a TGF-β1 responsive gene and its involvement in negative regulation of cell growth"Genomics. 80,5. 465-472 (2002)
• [文献書誌] 浅野間和夫 他: "癌遺伝子治療への臨床応用"産婦人科の実際. 51 10. 1407-1413 (2002)
• [文献書誌] Asanoma K et al.: "NECC1, a candidate choriocarcinoma suppressor gene with encodes homodomain consensus motif"Genomics. (in press).