網膜グリア細胞の形質制御による糖尿病網膜症の予防と治療法の基礎研究

• 研究課題/領域番号: 14657448
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 眼科学
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 澤田 典均 札幌医科大学, 医学部, 教授 (30154149)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円); 2003年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円); 2002年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: 血液脳関門 / 血液網膜関門 / タイト結合 / MAPK / PKA / 糖尿病網膜症 / グリア細胞 / 血管透過性 / VEGF / GDNF / AGE

研究概要

血液網膜関門(BRB)や血液脳関門(BBB)の本体は、血管内皮細胞のタイト結合である。そこでこれらの細胞のタイト結合に発現しているclaudin-1とclaudin-5に着目して、テトラサイクリン依存性転写因子(tet-on system)を導入した血管内皮細胞株(RLE)を用いて、claudin-1とclaudin-5の発現調節によるタイト結合機能制御機構を検討した。
1.野生型またはMAPキナーゼ(MAPK)の標的部位と想定されるThr203をAlaに置換したclaudin-1遺伝子を導入し、それらの発現を随時誘導できるRLE細胞株を樹立した。この血管内皮細胞にclaudin-1の発現を誘導すると、野生型、変異型claudinの両者とも、機能的なタイト結合を再構成した。さらにThr203をAlaに置換したclaudin-1を発現誘導しMAPK阻害剤を作用させた実験から、MAPKがclaudin-1タンパクを標的分子としてタイト結合のバリア機能を増強すること、claudin-1配列内のThr^<203>がTriton-X100非可溶性claudin-1の量やタイト結合のバリア機能に関与していることが明らかになった。
2.野生型またはPKAの標的部位と想定されるThr207をAlaに置換したclaudin-5遺伝子を導入し、それらの発現を随時誘導できるRLE細胞株を樹立した。この細胞株にこれらのclaudin-5を発現させて解析したところ、野生型、変異型claudinの両者とも内皮細胞のタイト結合を再構成すること、claudin-5のThr207がPKAによるリン酸化部位であること、そのリン酸化が内皮細胞のバリア機能の制御に重要な役割を果たすことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Sawada N et al.: "Tight junctions and human diseases."Med Electron Microsc.. 36. 147-156 (2003)
• [文献書誌] Kojima T et al.: "Regulation of the blood-biliary barrier : interaction between gap and tight junctions in hepatocytes."Med Electron Microsc.. 36. 157-164 (2003)
• [文献書誌] 澤田典均 他: ""すきま"の細胞生物学 細胞間接着装置タイト結合とヒト疾患"札幌医学雑誌. 72. 1-7 (2003)
• [文献書誌] Chiba H et al.: "Hepatocyte nuclear factor (HNF)-4α triggers formation of functional tight junctions and establishment of polarized epithelial morpgology in F9 embryonal carcinoma cells."Exp Cell Res.. 286. 288-297 (2003)
• [文献書誌] Ishizaki M et al.: "Cyclic AMP induces phosphorylation of claudin-5-immunoprecipitates and expression of claudin-5 gene in blood-brain-barrier endothelial cells via protein kinase A-dependent and -independent pathways."Exp Cell Res.. 290. 275-288 (2003)
• [文献書誌] Kojima T et al.: "Role of the p38 MAP-kinase signaling pathway for cx32 and claudin-1 in the rat liver."Cell Communication and Adhesion.. 10. 1-7 (2003)
• [文献書誌] Tobioka H et al.: "Occludin expression decreases with the progression of human endome trialcarcinoma."Human Pathol.. 35. 159-164 (2004)
• [文献書誌] Tokunaga Y et al.: "Expression of occludin in human rectal carcinoid tumours as a possible marker for glandular differentiation."Histopathology.. 44. 247-250 (2004)
• [文献書誌] 小島隆 他: "ギャップ結合とタイト結合-形態学的関係から機能的関係へ-"顕微鏡学会誌. 印刷中.
• [文献書誌] Kojima T et al.: "Inhibition of MAP-kinase activity moderates changes in expression and function of Cx32 but not claudin-1 during DNA synthesis in primary cultures of rat hepatocytes."Med Electron Microsc.. in press.
• [文献書誌] Fujibe M et al.: "Thr203 of claudin-1, a putative phosphorylation site for MAP kinase, is required to promote the barrier function of tight junctions."Exp Cell Res.. in press.
• [文献書誌] Takakuwa Y et al.: "Bile canalicular barrier function and expression of tight junctional molecules in rat hepatocytes during common bile duct ligation"Cell Tissue Res.. 307・2. 181-189 (2002)
• [文献書誌] Tobioka H et al.: "Polarised distribution of carcinoembryonic antigen is associated with a tight junction in human colorectal adenocarcinomas"J Pathol.. 198・2. 207-212 (2002)
• [文献書誌] Kojima T et al.: "Cx32 formation and/or cx32-mediated intercellular communication induce expression and function of tight junctions in hepatocytic cell line"Exp Cell Res.. 276・1. 40-51 (2002)
• [文献書誌] Osanai M et al.: "Hepatocyte Nuclear Factor (HNF)-4α induces expression of endothelial Fas ligand (FasL) to prevent cancer cell transmigration : A novel defense mechanism of encothelium against cancer metastasis"Jpn J Cancer Res.. 93・5. 532-541 (2002)
• [文献書誌] Kamimura Y et al.: "Barrier function of microvessels and roles of glial cell line-derived neurotrophic factor in the rat testis"Med Electron Microsc.. 35・3. 139-145 (2002)
• [文献書誌] Chiba H et al.: "Hepatocyte nuclear factor (HNF)-4α triggers formation of functional tight junctions and establishment of polarized epithelial morpgology in F9 embryonal carcinoma cells"Exp Cell Res.. (in press).
• [文献書誌] 澤田典均: "病気と細胞内小器官"森道夫編著・文光堂. 236 (2002)