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膜七回貫通型のヒト・アドレナリン受容体の結晶化とX線結晶構造解析

研究課題

研究課題/領域番号 14657579
研究種目

萌芽研究

配分区分補助金
研究分野 生物系薬学
研究機関東京大学

研究代表者

佐藤 能雅  東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (30150014)

研究分担者 水谷 隆太  東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (70272482)
野口 修治  東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (60237823)
研究期間 (年度) 2002 – 2004
研究課題ステータス 完了 (2004年度)
配分額 *注記
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2004年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2003年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2002年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
キーワード七回膜貫通型受容体 / 分泌シグナル / 膜タンパク質 / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / 糖タンパク質 / 蛋白質発現 / 酵母 / アドレナリン / コドン / メタノール資化酵母 / 糖鎖
研究概要

細胞膜をαヘリックスが7回貫通する膜七回貫通型受容体は,アゴニストと特異的に結合して活性化し,細胞内にリガンド結合の情報を伝達する。本研究では,この受容体で代表的なヒトβ2アドレナリン受容体の構造をX線結晶解析により明らかにし,その機能の薬理学的な理解を得るために,結晶化に向けた,受容体を高純度で大量に調製する方法の構築を目的とした。
メタノール資化性酵母Pichia pastorisの発現ベクターのpPIC9K(酵母のα-ファクターの分泌シグナルを利用)をこれまで調製したが,さらに,pPIC9とpPICZαのベクターに本受容体の遺伝子を組み込んだベクターを調製し,酵母のゲノム中に挿入した発現株を作製した。
受容体のヒト遺伝子には,酵母では使用されないあるいは使用頻度が低いコドン(レアコドン)が含まれることから,酵母で使用されるコドンに置き換えたコドン最適化のコンストラクトを調製し,組換え株を得た。この最適化と培養法の改良により,糖タンパク質である本受容体の発現量を向上させた。
ベクターをゲノム中にできるだけ多く組み込まれたpPIC9Kマルチプルコピー株を調製し,ホストとしてSMD1168株を用いたところ,従来の蛋白質発現株に比して,さらに数倍高い発現レベルが得られた。しかし,ファーメンター装置による高密度での細胞培養では,発現が著しく減少した。一方,pPIC9株あるいはpPICZα株の培養では,高密度でも発現は良好であった。
精製では,PEGを用いて受容体を沈澱させて回収,種々の界面活性剤による可溶化,アフィニティーカラム,ゲル濾過カラムなどを用いる精製条件を種々検討した。また,受容体のリガンド結合活性を検定する方法を改良し,精製試料を短時間で大量に調製し,結晶化する見通しを得た。

報告書

(3件)
  • 2004 実績報告書
  • 2003 実績報告書
  • 2002 実績報告書
  • 研究成果

    (7件)

すべて 2004 その他

すべて 雑誌論文 (3件) 文献書誌 (4件)

  • [雑誌論文] Protein splicing of yeast VMA1-derived endonuclease via thiazolidine intermediates2004

    • 著者名/発表者名
      R.Mizutani, Y.Anraku, Y.Satow
    • 雑誌名

      J.Synchrotron Radiation 11

      ページ: 109-112

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Expression, purification, and characterization of recombinant human β-galactosidase Using Pichia pastoris2004

    • 著者名/発表者名
      T.Ochi, R.Mizutani, Y.Satow
    • 雑誌名

      Proc.Pharmaceutical Sciences World Congress PSWC2004

      ページ: 354-354

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Expression of human β_2-adrenergic receptor with the sequence of optimized codon-usage in Pichia pastoris2004

    • 著者名/発表者名
      S.Noguchi, N.Suzuki, Y.Satow
    • 雑誌名

      Proc.Pharmaceutical Sciences World Congress PSWC2004

      ページ: 310-310

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [文献書誌] U.Ohto, R.Mizutani, M.Nakamura, H.Adachi, Y.Satow: "Crystal Structure of a Humanized Fab Fragment of Anti-Tissue-Factor Antibody in Complex with Tissue Factor"J.Synchrotron Radiation. 11. 105-108 (2004)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書
  • [文献書誌] U.Ohto, R.Mizutani, M.Nakamura, H.Adachi, Y.Satow: "Crystal Structure of the Human Tissue Factor Complex with Its Cognate Humanized Antibody Fab : Structural Basis of the Inhibition of Blood Coagulation"J.Pharm.Soc.Jpn.. 123・S2. 203 (2003)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書
  • [文献書誌] U.Ohto, R.Mizutani, M.Nakamura, H.Adachi, Y.Satow: "Crystal Structure of a Humanized Fab Fragment of Anti-Tissue-Factor Antibody in Complex with Tissue Factor"Proc.International Symp.on Diffraction Structural Biology 2003. 98 (2003)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書
  • [文献書誌] Y.Nitanai, Y.Satow, H.Adachi, M.Tsujimoto: "Crystal Structure of Human Renal Dipeptidase Involved in β-Lactam Hydrolysis"J.Mol.Biol.. 321. 177-184 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書

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公開日: 2002-04-01   更新日: 2016-04-21  

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