全真核細胞に適用可能な新規遺伝子破壊法の開発

• 研究課題/領域番号: 14658220
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 分子生物学
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 関 政幸 東北大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (70202140)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2003年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 2002年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: Xenopus Eggs Extract / RAD51 / RAD54 / RECQL4 / BRC4 / ノックアウト / RPA

研究概要

本研究では、試験管内で様々に加工した二本鎖DNA/組換えタンパク質RAD51を調製し、それを核の標的遺伝子座にターゲットインテグレーションさせる新規遺伝子破壊法の確立を目指した。実際には、カエル精子をカエル卵抽出液中で反応させて構築した核を標的として、全ての反応を試験管内で完結できるようにした。残念ながらRAD51の調製に難航し、最終的なジーシターゲッティングの成功までには至らなかったが、試験管内で以下の相同組換え反応を再現できた。1)反応系にEcoRIを加えて精子DNAに二重鎖切断(DSB)を導入したところ、RPAが集積し、さらにはRAD51が精子核にリクルートされた。2)さらにRAD51が集積した近辺でgemininに耐性のDNA合成、すなわちDNA修復合成活性を見いだした(J.Cell.Sci.,2002)。3)ここで抽出液からRPAを除去すると、EcoRIで形成されたDSBにRAD51がリクルートされないことを証明した。4)一方RAD51の反応をBRC4を添加して阻害すると、EcoRI誘導のRAD51のクロマチンへの結合が阻害された。この条件下でRPAのクロマチンへの結合はBRC4の有り無しで影響を受けないが、ヒト早老症ロスムンドートムソン症候群原因産物RECQL4のEcoRIで誘導されるクロマチン結合は有意に減少した。逆にRECQL4を反応液から枯渇させるとEcoRI誘導RAD51のクロマチンへの結合速度が遅れた。5)さらにRECQL4の枯渇とBRC4添加によるRAD51の阻害をいっぺんに行うとEcoRIによって生じたDSBのDNA修復合成に必要と考えられるDNAポリメラーゼαのクロマチンへの結合が消失した。以上の本研究を通じ、カエル卵抽出液中で相同組換え反応を解析できることを立証し、ジーンターゲッティングを試験管内で再構成するための実験系を提示できた。

研究成果

• [文献書誌] Odagiri, N., Seki, M., Onoda, F., Yoshimura, A., Watanabe, S., Enomoto, T.: "Budding yeast mms4 is epistatic with rad52 and the function of Mms4 can be replaced by a bacterial Holiday junction resolvase"DNA repair. 2. 347-358 (2003)
• [文献書誌] Wang, W., Seki, M., Narita, Y., Nakagawa, T., Yoshimura, A., Otsuki, M., Kawabe, Y., Tada, S., Yagi, H., Ishii, Y., Enomoto., T.: "Functional relation among RecQ family helicases, RecQL1, RecQL5, and BLM in cell growth and SCE formation."Mol.Cell.Biol.. 23. 3527-3535 (2003)
• [文献書誌] Wang, W., Seki, M., Otsuki, M., Tada, S., Takao, N., Yamamoto, KI., Hayashi, M., Honma, M., Enomoto, T.: "The absence of a functional relationship between ATM and BLM, the components of BASC, in DT40 cells"Biochim.Biophys.Acta.. 1688. 137-144 (2004)
• [文献書誌] Maeda, D., Seki, M., Onoda, F., Branzei, D., Kawabe, Y., Enomoto, T.: "Ubc9 is required for damage-tolerance and damage-induced interchromosomal homologous recombination in S.cerevisiae"DNA repair. 3. 335-341 (2004)
• [文献書誌] Onoda, F., Takeda, M., Seki, M., Maeda, D., Tajima, J., Ui, A., Yagi, H., Enomoto, T.: "SMC6 is required for MMS-induced interchromosomal and sister chromatid recombinations in Saccharomyces cerevisiae."DNA repair. 3. 429-439 (2004)
• [文献書誌] Onodera, R., Seki, M., Ui, A., Satoh, Y., Miyajima, A., Onoda, F., Enomoto, T.: "Functional and physical interaction between Sgs1 and Top3 and Sgs1-independent function of Top3 in DNA recombination repair"Gen. Genet. Syst.. 77. 11-21 (2002)
• [文献書誌] Kobayashi, T., Tada, S., Tsuyama, T., Morohushi, M., Seki, M., Enomoto, T.: "Focus-formation of replication protein A, activation of checkpoint system and DNA repair synthesis induced by DNA double-strand breaks in cell-free extract derived from Xenopus eggs"J. Cell. Sci.. 115. 3159-3169 (2002)
• [文献書誌] Branzei, D, Seki, M., Onoda, F., Enomoto, T.: "The product of Saccharomyces cerevisiae WHIP/MGS1, a gene related to replication factor C genes, interacts functionally with DNA polymerase δ"Mol Genet Genomics.. 268. 371-386 (2002)
• [文献書誌] Hayashi, T., Seki, M., Maeda, D., Wang, W., Kawabe, T., Seki, T., Saitoh, H., Fukagawa, T., Yagi, H., Enomoto, T.: "Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells"Exp Cell Res.. 280. 212-221 (2002)
• [文献書誌] Branzei, D, Seki, M., Onoda, F., Yagi, H., Kawabe, Y., Enomoto, T.: "Characterization of the slow-growth phenotype of S. cerevisiae whip/mgs1 sgs1 double deletion mutants"DNA Repair. 1. 671-682 (2002)
• [文献書誌] Odagiri, N., Seki, M., Onoda, F., Yoshimura, A., Watabane, S., Enomoto T.: "Budding yeast mms4 is epistatic with rad52 and the function of Mms4 can be replaced by a bacteria Holliday junction resolvase"DNA repair. 2. 347-358 (2003)
• [文献書誌] Wang, W., Seki, M., Narita, Y., Nakagawa, T., Yoshimura, A., Otsuki, M., Kawabe, Y., Tada, S., Yagi, H., Ishii, Y., Enomoto, T.: "Functional relation among RecQ family helicases, RecQL1, RecQL5, and BLM in cell growth and SCE formation"Mol. Cell. Biol.. (in press).