新しいトランスジェニック魚を用いた網膜生理学研究の展開

• 研究課題/領域番号: 14658267
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 神経・筋肉生理学
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 加藤 聖 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (10019614)
• 研究分担者: 荒井 國三 金沢大学, 自然科学研究科, 講師 (50126562) ; 松川 通 金沢大学, 医学系研究科, 助手 (30219414)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2004年度: 700千円 (直接経費: 700千円); 2003年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2002年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
• キーワード: 金魚 / ゼブラフィッシュ / 神経再生 / クローニング / プルプリン / トランスグルタミネース / RNAi / リコンビナント蛋白 / 遺伝子 / 過剰発現 / 中枢神経再生 / ゲノムDNAライブラリー / レチノール結合タンパク

研究概要

魚は哺乳類と異なり中枢神経軸索の損傷を受けても再生する。我々は視神経をモデルとして魚類の神経両生分子をクローニングし、プルプリン、トランスグルタミネース等をクローニングした。これら分子のcDNA全長を得、まずプラスミドに組み込み大腸菌にトランスフェクションし(1)リコンビナント蛋白を精製した。(2)この蛋白からペプチド抗体やウサギに免疫し抗体を作製した。(3)更に標的遺伝子特異的なRNAiを行なうためsiRNA用のプライマーを設計した。ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして、標的遺伝子のルシフェラーゼ活性を指標に遺伝子発現の抑制量より適するプライマーを取得した。網膜組織培養切片を用いて神経突起の伸長(神経の再生)を見た所、プルプリンやトランスグルタミネースのリコンビナント蛋白の添加により著明な神経突起の伸長が見られた。逆に抗体の添加により神経突起の伸長が抑えられた。また、リポフェクタミン2000の共存下にsiRNAを添加したところ、ランダムプライマーによるmock実験と比べて著明に神経突起の伸展が抑制された。以上の結果より、見つかったプルプリン、トランスグルタミネースが網膜の神経節細胞の軸索伸長(視神経の再生)に大きく関わっていることが判明した。現在、ウィルスベクターによる過剰発現の影響と哺乳類網膜への導入実験を行っている。この様に魚で得られた遺伝子の導入や抑制実験により新しい網膜での機能が明らかにされた。

研究成果

• [雑誌論文] Axonal regeneration of fish optic nerve after injury (2004)
  • 著者名/発表者名: Matsukawa, T., Arai, K., Koriyama, Y., Liu, Z.W., Kato, S
  • 雑誌名: Biol.Pharm.Bull. 27・4 ページ: 445-451
  • NAID: 110003608783
• [雑誌論文] Role of purpurin as a retinol-binding protein in goldfish retinas during the early stage of optic nerve regeneration (2004)
  • 著者名/発表者名: Matsukawa, T., Sugitani, K., Mawatari, K., Koriyama, Y., Liu, Z.W., Tanaka, M., Kato, S.
  • 雑誌名: J.Neurosci. 24・38 ページ: 8346-8353
• [雑誌論文] A computer image processing system for quantification of zebrafish behavior. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kato, S., Nakagawa, T., Ohkawa, M., et al.
  • 雑誌名: J.Neurosci.Methods 134・1 ページ: 1-7
• [雑誌論文] 金魚の神経再生モデル (2004)
  • 著者名/発表者名: 郡山恵樹, 松川 通, 安田里愛, 加藤 聖
  • 雑誌名: Clinical Neuroscience 22 ページ: 1059-1061
• [雑誌論文] 損傷後の中枢神経軸索再生の分子機構-金魚視神経をモデルとして- (2004)
  • 著者名/発表者名: 田中聖之, 郡山恵樹, 渡辺雄大, 塚原みゆき, 松川 通, 加藤 聖
  • 雑誌名: リハビリテーション医学別冊 41 ページ: 735-767
  • NAID: 130003663724
• [文献書誌] Takizawa, N., Tanaka, M., Liu, Z.W., Kato, S.: "A dissociation of γ-butyrolactone-induced absence seizure and ORE- and AP-1 DNA-binding activities in the developing rat brain"Neurosci.Res.. 45・4. 483-490 (2003)
• [文献書誌] Kato, S., Nakagawa, T., Ohkawa, M.et al.: "A computer image processing system for quantification of zebrafish behavior"J.Neurosci. Methods. 134・1. 1-7 (2004)
• [文献書誌] Matsukawa, T., Arai, K., Koriyama, Y., Liu, Z.W., Kato, S.: "Axonal regeneration of fish optic nerve after injury"Biological & Pharmaceutical Bulletin. in press. (2004)
• [文献書誌] Liu, Z.W., Matsukawa, T., Arai, K., Devadas, M., Nakashima, H., Tanaka, M., Mawatari, K., Kato, S.: "Na,K-ATPase, alpha 3 subunit in the goldfish retina during optic nerve regeneration"J. Neurochemistry. 80(5). 763-770 (2002)
• [文献書誌] Takizawa, N., Tanaka, M., Liu, ZW., Koriyama, Y., Matsukawa, T., Kato, S.: "A dissociation of γ-butyrolactone-induced absence seizure and CRE-and AP-1 DNA-binding activities in the developing rat brain"Neurocsi. Res.. (In press). (2003)
• [文献書誌] Sugitani, K., Devadas, M., Liu, ZW., Sugawara, K., Matsukawa, T., Ishita, S., Kato, S.: "The Goldfish Visual System as a Useful Model for CNS regeneration : from Gene to Behavior"Recent Research Developments in Neurochemistry. (In press). (2003)