有機フッ素化合物のバイオコンバージョン:フッ素脱離・導入の酵素触媒機構と応用

• 研究課題/領域番号: 14703021
• 研究種目: 若手研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物・生体工学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 助教授 (70243087)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 28,730千円 (直接経費: 22,100千円、間接経費: 6,630千円); 2004年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円); 2003年度: 7,410千円 (直接経費: 5,700千円、間接経費: 1,710千円); 2002年度: 13,910千円 (直接経費: 10,700千円、間接経費: 3,210千円)
• キーワード: フルオロ酢酸デハロゲナーゼ / 有機フッ素化合物 / 脱ハロゲン / 2-ハロアクリル酸レダクターゼ / 有機ハロゲン化合物 / 不斉還元 / Burkholderia / 2-クロロプロピオン酸 / フルオロ酢酸 / 2-ハロ酸 / 2-ハロ酸デハロゲナーゼ

研究概要

1.フルオロ酢酸デハロゲナーゼの構造と機能
フルオロ酢酸デハロゲナーゼはフルオロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、グリコール酸を与える。脂肪族フッ素化合物の強固な炭素-フッ素結合の切断を触媒する唯一の既知酵素である。本酵素はフルオロ酢酸を最も良好な基質とするが、クロロ酢酸にも、その4%の活性を示す。本酵素反応では、触媒中心アスパラギン酸残基の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を求核攻撃し、ハライドイオンが脱離するとともに、酵素と基質が共有結合したエステル中間体が生成する。続いてヒスチジン残基が活性化した水分子によって中間体が加水分解され、グリコール酸が遊離するとともに、触媒中心アスパラギン酸残基が再生する。本研究では、Burkholderia sp.FA1が生産する本酵素の構造と機能を解析した。結晶構造解析によって活性部位に存在することが示されたアミノ酸残基を部位特異的変異法で改変し、触媒能への影響を調べた。触媒中心のAsp104、His271のほか、これらの近傍に存在するArg105、His149、Arg108、Tyr147、Phe34、Tyr212、Phe272、His103をアラニン残基に改変すると、フルオロ酢酸とクロロ酢酸のいずれに対する活性も消失した。一方、Trp150をアラニン残基に改変した酵素では、クロロ酢酸に対する活性は野生型酵素の71%残存したにもかかわらず、フルオロ酢酸に対する活性は完全に消失した。Trp150はフッ化物イオンの脱離に必須の役割を果たすことが示された。
2.2-ハロアクリル酸レダクターゼの発見と機能解析
2-クロロアクリル酸資化性菌Burkholderia sp.WSが、NADPHを還元剤として2-ハロアクリル酸の不斉還元を触媒する新奇酵素2-ハロアクリル酸レダクターゼを生産することを明らかにした。本酵素と補酵素再生系を組み合わせることにより、除草剤の原料として有用な(S)-2-クロロプロピオン酸を効率よく生産することに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] The putative malate/lactate dehydrogenase from Pseudomonas putida is an NADPH-dependent Δ1-piperideine-2-carboxylate/Δ1-pyrroline-2-carboxylate reductase involved in the catabolism of D-lysine and D-proline (2005)
  • 著者名/発表者名: Muramatsu, Hisashi et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280・7 ページ: 5329-5335
• [雑誌論文] N-Methyl-L-amino acid dehydrogenase from Pseudomonas putida. A novel member of an unusual NAD(P)-dependent oxidoreductase superfamily (2005)
  • 著者名/発表者名: Mihara, Hisaaki et al.
  • 雑誌名: FEBS J. 272・5 ページ: 1117-23
• [雑誌論文] 2-Haloacrylate reductase : A novel enzyme of the medium-chain dehydorogenase/reductase superfamily that catalyzes the reduction of a carbon-carbon double bond of unsaturated organohalogen compounds (2005)
  • 著者名/発表者名: Kurata, Atsushi et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. (In press)
• [雑誌論文] Symmetric reduction of 2-chloroacrylic acid to (S)-2-chloropropionic acid by a novel reductase from Burkholderia sp.WS (2004)
  • 著者名/発表者名: Kurata, Atsushi et al.
  • 雑誌名: Tetrahedron Asymmetr. 15 ページ: 2837-2839
• [雑誌論文] Enzymatic synthesis of N-methyl-L-phenylalanine by a novel enzyme, N-methyl-L-amino acid dehydrogenase, from Pseudomonas putida (2004)
  • 著者名/発表者名: Muramatsu, Hisashi et al.
  • 雑誌名: Tetrahedron Asymmetr. 15 ページ: 2841-2843
• [文献書誌] Kurihara, Tatsuo at al.: "Purification, characterization, and gene cloning of a novel fluoroacetate dehalogenase from Burkholderia sp. FA1"J.Mol.Catal.B : Enzym.. 23. 347-355 (2003)
• [文献書誌] Li, Yong-Fu et al.: "Mass spectrometric analysis of the reactions catalyzed by L-2-haloacid dehalogenase mutants and implications for the roles of the catalytic amino acid residues"J.Mol.Catal.B : Enzym.. 23. 337-345 (2003)
• [文献書誌] Park, Chung et al.: "A new DL-2-haloacid dehalogenase acting on 2-haloacid amides : purification, characterization, and mechanism"J.Mol.Catal.B : Enzym.. 23. 329-336 (2003)
• [文献書誌] Ichiyama, Susumu et al.: "Reactivity of asparagine residue at the active site of the D105N mutant of fluoroacetate dehalogenase from Moraxella sp. B"Biochim.Biophys.Acta. 1698. 27-36 (2004)
• [文献書誌] Ichiyama, Susumu et al.: "Catalysis-linked inactivation of fluoroacetate dehalogenase by ammonia : a novel approach to probe the active-site environment"J. Biochem.. 131・5. 671-677 (2002)
• [文献書誌] Park, Chung et al.: "A new DL-2-haloacid dehalogenase acting on 2-haloacid amides : purification, characterization, and mechanism"J. Mol. Catal. B : Enzym.. (In press). (2003)
• [文献書誌] Li, Yong-Fu et al.: "Mass spectrometric analysis of the reactions catalyzed by L-2-haloacid dehalogenase mutants and implications for the roles of the catalytic amino acid residues"J. Mol. Catal. B : Enzym.. (In press). (2003)