TransferRNA分子におけるクローバーリーフ構造の安定化戦略の解明

• 研究課題/領域番号: 14704011
• 研究種目: 若手研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 応用微生物学・応用生物化学
• 研究機関: 豊橋技術科学大学
• 研究代表者: 田中 照通 豊橋技術科学大学, 工学部, 助教授 (30273337)
• 研究期間 (年度): 2002 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 29,770千円 (直接経費: 22,900千円、間接経費: 6,870千円); 2004年度: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2003年度: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2002年度: 20,670千円 (直接経費: 15,900千円、間接経費: 4,770千円)
• キーワード: Ribonuclease P / tRNA / cloverleaf / intron / extra variable loop / coevolution / ribonuclease P / Ribozyme / long extra loop

研究概要

tRNAはタンパク質生合成系におけるアミノ酸の運び手であり遺伝暗号の担い手でもある基本的な生体分子である。この分子は細胞内に約50種存在するが、その構造は対応するアミノ酸や由来する生物種を超えて共通のクローバーリーフ構造をとっている。この構造の維持は効率的なタンパク質合成においては必須の条件であるため、それぞれの生物種においてそれぞれのtRNA分子は何らかの構造安定化戦略をとっているものと考えられる。tRNA分子の安定化に種々の塩基修飾が寄与していることは既に知られているが、本申請研究では、塩基修飾を受ける以前のtRNA前駆体における安定性を1つの評価の指標とした。tRNA前駆体分子の安定性は、きちんとした成熟化tRNAの生成の条件であり、重要な評価の基準となる。tRNA分子の安定性の評価の方法としては、「大多数」を評価するための統計的な状態を反映する方法と、「微量な」変性を検出するための方法とを採用した。
「微量な」構造変性を検出する方法として真正細菌リボヌクレアーゼPを採用した。この酵素はtRNA成熟化酵素の1つであり、「きちんと」フォールディングしたtRNA前駆体を基質とするが、同時に、高濃度Mgイオンの存在下ではCCA付きのヘアピン型RNAをも基質として認識できる。反応条件をコントロールすることで、変性したもしくはフォールディングに失敗したtRNAを検出することができる。この酵素による検出系では切断産物の蓄積を通して、微量な存在比のものでも検出ができるところにある。この方法によって既に幾つかのtRNAの安定性評価を行い、由来する生物種によってtRNAの構造安定性に差異があることを報告してきた。また、これらの実験結果は同じ細胞内におけるtRNA分子とリボヌクレアーゼP分子とにおける共進化モデルを与えた。
また、上記の方法論によってtRNAイントロンはtRNA前駆体における構造安定化装置ではなく別の意味を持つことや、数種のtRNA分子に見られる長いエクルトラループという部分構造がtRNA分子の安定化に大きく寄与していることなどが明らかとなった。
本研究においては併せて道具としてのリボヌクレアーゼPの酵素学的な性質を目指したが、研究の成果として真正細菌酵素の基質認識が反応条件や基質の形状、及び反応溶液中におけるリボゾームコンポーネントの存在などによっても変化することを明らかにすることができた。

研究成果

• [雑誌論文] The P3 domain of E.coil ribonuclease P RNA is able to be truncated and replaceable. (2004)
  • 著者名/発表者名: Terumichi Tanaka, et al.
  • 雑誌名: FEBS Letters 577 ページ: 101-104
• [雑誌論文] Mutational analyses on the length of J3/4 domain of Escherichia coli ribonuclease P ribozyme. (2004)
  • 著者名/発表者名: Shinnosuke Haga, et al.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68 ページ: 2630-2632
• [雑誌論文] Extracellular RNAs produced by a marine photosynthetic bacterium Rhodovulum sulfidophilum. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Ando, et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Symposium Series No.48 ページ: 165-166
• [雑誌論文] Mutational analyses of neighboring domains of active center of RNase P ribozyme. (2004)
  • 著者名/発表者名: Terumichi Tanaka, et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Symposium Series No.48 ページ: 201-202
• [雑誌論文] Natural intron sequence of human tyrosine pre-tRNA is not a temporal stabilizer for cloverleaf structure. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Ando, et al.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68 ページ: 1782-1785
• [雑誌論文] Examining the bases of J3/4 domain of E. coli ribonuclease P (2004)
  • 著者名/発表者名: Terumichi Tanaka, et al.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68 ページ: 1388-1392
• [雑誌論文] Substrate shape specificity of E. coli RNase P ribozyme is dependent on the concentration of magnesium ion (2003)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Ando et al.
  • 雑誌名: Journal of Biochemistry 133 ページ: 445-451
• [雑誌論文] E.coli tRNAs are resistant to the hyperprocessing reaction of homologous E.coli ribonuclease P ribozyme. (2003)
  • 著者名/発表者名: Terumichi Tanaka et al.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 67 ページ: 1172-1176
• [雑誌論文] Revisiting the substrate recognition of bacterial ribonuclease P --- in the view of the recognition of the base N73 in the substrate. (2003)
  • 著者名/発表者名: Terumichi Tanaka et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research Suppl.No.3 ページ: 275-276
• [雑誌論文] Bacterial ribonuclease P reaction is affected by substrate shape and magnesium ion concentration. (2003)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Ando et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research Suppl.No.3 ページ: 293-294
• [雑誌論文] Extracellular DNA and RNA produced by a marine photosynthetic bacterium Rhodovulum sulfidophilum. (2003)
  • 著者名/発表者名: Seiichiro Nishimura et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research Suppl.No.3 ページ: 279-280
• [雑誌論文] Recognition of tRNA variants by bacterial ribonuclease P. (2003)
  • 著者名/発表者名: Yasuhiro Nagai et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research Suppl.No.3 ページ: 281-282
• [雑誌論文] Comparative analyses on hairpin substrate recognition by E.coli and B.subtilis RNase P ribozymes. (2003)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Ando et al.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 67 ページ: 1823-1827
• [雑誌論文] The protein component of bacterial RNase P flickers the metal ion response of the substrate shape preference of the ribozyme. (2003)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Ando et al.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 67 ページ: 2294-2296
• [雑誌論文] Another cut for lysine tRNA : Application of the hyperprocessing reaction reveals another stabilization strategy in metazaon lysine tRNAs. (2002)
  • 著者名/発表者名: Terumichi Tanaka et al.
  • 雑誌名: Journal of Biochemistry 131 ページ: 839-847
• [雑誌論文] Kinetic analysis on hyperprocessing reaction of human tyrosine tRNA by E.coli ribonuclease P ribozyme. (2002)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Ando et al.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 66 ページ: 1967-1971
• [雑誌論文] Regulation of bacterial RNase P ribozyme by divalent cation and guide DNA. (2002)
  • 著者名/発表者名: Tomoaki Ando et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research Suppl.No.2 ページ: 271-272
• [雑誌論文] Porphyrins and porphines inhibit the ribonuclease P reaction in vitro. (2002)
  • 著者名/発表者名: Yoshiaki Hori et al.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research Suppl.No.2 ページ: 111-112
• [雑誌論文] Guide DNA technique in bacterial ribonuclease P reaction for effective processing of tRNA precursor. (2002)
  • 著者名/発表者名: Terumichi Tanaka et al.
  • 雑誌名: Biotechnology and Applied Biochemistry 36 ページ: 85-88
• [図書] 「生体の科学」53巻2号・特集「RNA」「RNA酵素に生命の謎解きができるか?」 (2002)
  • 著者名/発表者名: 田中照通, 菊池洋
  • 出版者: (財)金原一郎記念医学医療振興財団
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "Substrate shape specificity of E. coli RNase P ribozyme is dependent on the concentration of magnesium ion."Journal of Biochemistry. 133. 445-451 (2003)
• [文献書誌] Terumichi Tanaka et al.: "E. coli tRNAs are resistant to the hyperprocessing reaction of homologous E. coli ribonuclease P ribozyme."Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67. 1172-1176 (2003)
• [文献書誌] Terumichi Tanaka et al.: "Revisiting the substrate recognition of bacterial ribonuclease P --- in the view of the recognition of the base N73 in the substrate."Nucleic Acids Research. Suppl.No.3. 275-276 (2003)
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "Bacterial ribonuclease P reaction is affected by substrate shape and magnesium ion concentration."Nucleic Acids Research. Suppl.No.3. 293-294 (2003)
• [文献書誌] Seiichiro Nishimura et al.: "Extracellular DNA and RNA produced by a marine photosynthetic bacterium Rhodovulum sulfidophilum."Nucleic Acids Research. Suppl.No.3. 279-280 (2003)
• [文献書誌] Yasuhiro Nagai et al.: "Recognition of tRNA variants by bacterial ribonuclease P."Nucleic Acids Research. Suppl.No.3. 281-282 (2003)
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "Comparative analyses on hairpin substrate recognition by E. coli and B. subtilis RNase P ribozymes."Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67. 1823-1827 (2003)
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "The protein component of bacterial RNase P flickers the metal ion response of the substrate shape preference of the ribozyme."Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67. 2294-2296 (2003)
• [文献書誌] Terumichi Tanaka et al.: "Another cut for lysine tRNA : Application of the hyperprocessing reaction reveals another stabilization strategy in metazaon lysine tRNAs."Journal of Biochemistry. 131. 839-847 (2002)
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "Kinetic analysis on hyperprocessing reaction of human tyrosine tRNA by E. coli ribonuclease P ribozyme."Bioscience, biotechnology, and Biochemistry. 66. 1967-1971 (2002)
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "Regulation of bacterial RNase P ribozyme by divalent cation and guide DNA."Nucleic Acids Research. Suppl.No.2. 271-272 (2002)
• [文献書誌] Yoshiaki Hori et al.: "Porphyrins and porphines inhibit the ribonuclease P reaction in vitro."Nucleic Acids Research. Suppl.No.2. 111-112 (2002)
• [文献書誌] Terumichi Tanaka et al.: "Guide DNA technique in bacterial ribonuclease P reaction for effective processing of tRNA precursor."Biotechnology and Applied Biochemistry. 36. 85-88 (2002)
• [文献書誌] 田中照通, 菊池洋: "「生体の科学」53巻2号・特集「RNA」「RNA酵素に生命の謎解きができるか?」"(財)金原一郎記念医学医療振興財団. 136-141 (2002)
• [文献書誌] Terumichi Tanaka et al.: "Guide DNA technique in bacterial ribonuclease P reaction for effective processing of tRNA precursor"Biotechnology and Applied Biochemistry. 36. 85-88 (2002)
• [文献書誌] Terumichi Tanak et al.: "Another cut for lysine tRNA : Application of the hyperprocessing reaction reveals another stabilization strategy in metazaon lysine tRNAs"Journal of Biochemistry. 131. 839-847 (2002)
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "Kinetic analysis on hyperprocessing reaction of human tyrosine tRNA by E.coli ribonuclease P ribozyme"Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 66. 1967-1971 (2002)
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "Regulation of bacterial RNase P ribozyme by divalent cation and guide DNA"Nucleic Acids Research. Suppl.No.2. 271-272 (2002)
• [文献書誌] Yoshiaki Hori et al.: "Porphyrins and porphines inhibit the ribonuclease P reaction in vitro"Nucleic Acids Research. Suppl.No.2. 111-112 (2002)
• [文献書誌] Tomoaki Ando et al.: "Substrate shape specificity of E.coli RNase P ribozyme is dependent on the concentration of magnesium ion"Journal of Biochemistry. 133(No.4)(in press). (2003)
• [文献書誌] Terumichi Tanaka et al.: "E.coli tRNAs are resistant to the hyperprocessing reaction by homologous E.coli ribonuclease P ribozyme"Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 67(No.5)(in press). (2003)
• [文献書誌] Terumichi Tanaka et al.: "Revisiting the substrate recognition of bacterial ribonuclease P ---in the view of the recognition of the base N73 in the substrate"Nucleic Acids Research. Suppl.No.3(in press). (2003)
• [文献書誌] 田中照通, 菊池洋: "「生命の科学」53巻2号・特集「RNA」「RNA酵素に生命の謎解きができるか?」"(財)金原一郎記念医学医療振興財団. 6 (2002)