| 研究概要 |
(1)コリシンDの基質認識メカニズムの解明
コリシンDの活性ドメインおよびインヒビターとの共結晶構造を決定した。以前の研究成果より、コリシンDの活性中心残基をひとつ同定しており(His611)、これを元に残りの残基を構造データに基づき予測した。予測されたアミノ酸を置換した変異体コリシンDを発現、精製し、in vitroでの活性を調べた結果、Lys608を変異させた変異体コリシンDが著しい活性の低下を示した。このことから、Lys608が残りの活性中心残基であると考えられる。
(2)コリシンE5やDの応用的利用法の確立
コリシンおよびインヒビターを個々に発現するプラスミドをそれぞれ作製し、HeLa細胞に導入した。この細胞のタンパク合成活性を、同時に導入したプラスミドより発現するルシフェラーゼの合成量により評価した。その結果、野生型コリシンE5, Dを発現する細胞では、著しいタンパク合成低下が見られ、この活性はインヒビターを共発現させることにより阻害された。このことから、動物細胞内でも、コリシンE5, Dが活性を示し、また、インヒビターにより活性のオン・オフが可能であることが分かった。現在、コリシンE5,DをTet系により誘導発現出来るトランスジェニックマウスを作製中である。このマウスを解析することにより、tRNAの障害に対して個体レベルでどのような疾患が生じるか調べることが可能である。また、同時にコリシンをミトコンドリアに局在化させることにより、ミトコンドリアをノックダウンさせる系を、細胞レベルで構築中である。
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