| 研究課題/領域番号 |
14760046
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
山本 博規 信州大学, 繊維学部, 助手 (20262701)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
2004年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2003年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2002年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | 細胞表層蛋白質 / 菌体外プロテアーゼ / 細胞壁溶解酵素 / 局在部位 / LysM motif / peptidoglycan / 枯草菌 / 分泌プロテアーゼ / 表層プロテアーゼ / エピトープタグ / 細胞分離 / 細胞分裂 |
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| 研究概要 |
枯草菌における細胞表層蛋白質には、プロテアーゼや細胞壁溶解酵素を含む約20の蛋白質が存在する。7種類の分泌プロテアーゼ多重欠損株を用いた細胞表層蛋白質のプロテオーム解析により、主要な細胞表層蛋白質であるWapAのプロセッシングがEprによりなされていることを明らかにした。また栄養増殖期の細胞壁溶解酵素について3xFLAGエピトープtagを融合させ、免疫蛍光顕微鏡観察を行った結果、D, L-endopeptidaseであるLytF及びLytEは分裂面及び分裂後の極に局在し、細胞分裂の最終段階である細胞分離に機能している可能性が推測された。一方amidaseであるLytCは細胞表層にほぼ均一に分布していた。次に分泌プロテアーゼによる細胞表層蛋白質の分解を検出するために、3xFLAG融合蛋白質こついてWestern blot解析及びzymographyを行った。その結果、LytF及びLytEは表層プロテアーゼWprA及びEprにより分解を受けるのに対し、LytCはほとんど分解を受けないことが解った。さらにこの3xFLAGシステムを用いて、網羅的な細胞表層蛋白質の局在性並びに分泌プロテアーゼによる分解の有無を調べた。その結果、LytCのmodifierであるLytB、及びglucosaminidaseであるLytDはLytCと同様に細胞表層にほぼ均一に分布することが明らかになった。またD, L-endopcptidaseであるYojL、及び機能未知蛋白質であるYoeBは分裂面及び分裂後の極に局在し、同様に機能未知蛋白質であるYqgAは分裂面のみに局在することが解った。さらにWestern blot解析の結果、LytBはWprA及びEprによりほとんど分解を受けなかったのに対し、LytD、YojL、YoeB、及びYqgAは両プロテアーゼにより分解を受けることが明らかになった。また細胞表層蛋白質の安定性に影響を及ぼすことが明らかになった細胞表層プロテアーゼであるWprAに関してその局在部位を観察したところ、培地中の塩濃度が低い(NaCl濃度0.5%以下)場合には細胞の両極に局在し、塩濃度が高い(NaCl濃度1%以上)場合には細胞表層にほとんど局在できず培地中に遊離してしまうことが解った。さらに分裂面及び分裂後の両極に見られるLytFの局在性は、細胞壁の構成成分であるpeptidoglycanを特異的に認識することによりなされている可能性が示唆された。
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