| 研究概要 |
高度好塩菌Halobacterium salinarum由来nucleoside diphosphate kinase (HsNDK)は大腸菌内で発現したが、培地1Lあたり0.5mgと少量でしかも濃い塩に一旦さらさないと活性は無かった。しかし、His-tagフラグメントを付加したHisHsNDKは培地1Lあたり30mgと大量に発現した。しかもHisHsNDKは酵素活性を保持した状態で発現した。これは高度好塩菌由来の酵素が通常生物である大腸菌内で発現した最初の例である。In vitroの系でも変性後の巻き戻りがHis-tagの付加により促進された。
また、HsNDKは3.8 M NaCl存在下でのみ6量体だがHisHsNDKは0.2 M,3.8 M NaClどちらの存在下でも6量体が存在した。6量体の安定化や高濃度塩存在下での巻き戻りは塩による負電荷の遮蔽が関係しているのではないかと考え,Trimethylamine N-oxide(TMAO)存在下でのリフォールディング実験を行った。HsNDKは4Mの濃度でかつ、その時のpHがpH8.0以上では巻き戻らなかった。これはHsNDKの負電荷どうしが反発をおこした為だと考えられた。それ故負電荷遮蔽の目的で薄いNaClを加えるとpH8.0以上でもHsNDKは巻き戻った。一方,HisHsNDKは4 M TMAO(pH8.3)存在下でも巻き戻る事が出来た。この事はpH8.0以上でもHisHsNDKのHis-tagフラグメントが負電荷を遮蔽し,負電荷どうしの反発を抑え,巻き戻りを促進させたことを示唆している。この事よりHisHsNDKの大腸菌内での活性化,巻き戻り効率の促進,6量体の形成はHis-tagフラグメント中の6個のHisと1個のArgによる重要な部位の負電荷の遮蔽によるものだと推察された。
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